一、免疫組織化學 (IHC-Fr)-冷凍切片切割技術

冷凍切片：切片經 3-氨基-丙酯-三-乙氧基-硅烷（APES）包被玻片封固后，最好在 -80°C下保存，需要時再取出。

1.需要時取出后室溫恢復 5 分鐘。

2.-20°C 預冷固定劑（丙酮、甲醇或乙醇）30 分鐘。（首推丙酮）

3.冷固定劑室溫固定 5-10 分鐘。

4.PBS 漂洗 3×4 分鐘。

5.參照手冊繼續(xù)染色。

非醛類固定時不需進行抗原修復步驟。但是如果冷凍組織或細胞經福爾馬林固定，就需要進行抗原修復。但易碎的樣本，如大腦組織或會影 響結果。下面的參考文獻介紹了將切片放置在玻片上之前怎樣用 3-氨基-丙酯-三-乙氧基-硅烷 (APES) 處理玻片。這種處理方法能提高粘附力， 使抗原熱修復對組織形態(tài)的損害降到最低：

Warembourg M, Leroy D., Microwave pretreatment of sections to improve the immunocytochemical detection ofprogesterone receptors in the guinea pig hypothalamus. J Neurosci Methods. 2000 Dec 15;104(1):27-34.

關于冷凍組織切片抗原修復更加深入的討論見下面的參考文獻。

Yamashita S, Okada Y. Application of heat-induced antigen retrieval to aldehyde fixed fresh frozen sections. J HistochemCytochem. 2005 Nov;53(11):1421-32.

如果組織樣品是醛類固定劑如福爾馬林、多聚甲醛、戊二醛等固定的或用免疫熒光法檢測的，在加一抗之前用含 0.3M 甘氨酸的封閉液封閉。因為甘氨酸能結合自由醛基，而這些醛基會與一抗和二抗結合造成高背景染色。使用多聚甲醛或戊二醛固定時，由自由醛基導致的高背景很有可能發(fā)生。

IHC-石蠟操作指南中 (IHC-P) 有關于顯色和熒光檢測石蠟技術的詳細介紹。

二、免疫細胞化學 (ICC) 指南一般步驟

1.加蓋玻片，聚氮丙啶或多聚左旋賴氨酸室溫作用 1 小時。

2.滅菌水漂洗蓋玻片 3×5 分鐘。

3.蓋玻片徹底干燥后，紫外燈滅菌至少 4 小時。

4.玻璃蓋玻片上種上細胞，或制作細胞樣本或涂片標本。

5.磷酸鹽緩沖液（PBS）漂洗。

固定

1.冷甲醇、丙酮固定樣品 1-10 分鐘，或含 3-4% 多聚甲醛 pH 7.4 的 PBS 室溫固定 15 分鐘。

2.冷PBS沖洗樣品2次。

通透

如果靶蛋白是細胞內表達的，那么使細胞膜變通透就很重要了。注：丙酮固定的樣品不需要通透。

3.將樣品在含 0.25% Triton X-100（或 100μM 洋地黃皂苷或 0.5% 皂角苷）的 PBS 中孵育 10 分鐘。Triton X-100 是最常用的去

污劑，能增 強抗體的穿透力。因為它對細胞膜有損壞作用，因此不適用于與細胞膜結合的抗原。

4.PBS 沖洗細胞 3×5 分鐘。

封閉及孵育

5.細胞在含1%BSA的PBST（封閉液也可以選擇含1%明膠或10% 與二抗同種動物來源的血清）中孵育30分鐘，以阻斷抗體的非特異性結合。

如果組織樣品是醛類固定劑如福爾馬林、多聚甲醛、戊二醛等固定的或用免疫熒光法檢測的，在加一抗之前用含 0.3M 甘氨酸的封閉液封閉。因為甘氨酸能結合自由醛基，而這些醛基會與一抗和二抗結合造成高背景染色。使用多聚甲醛或戊二醛固定時，由自由醛基導致的高背景很有可能發(fā)生。

IHC-石蠟操作指南中 (IHC-P) 有關于顯色和熒光檢測石蠟技術的詳細介紹。

6.細胞與抗體（含 1% BSA 的 PBST 稀釋）在濕盒中共同孵育，室溫 1 小時，或 4°C 過夜。

7.棄去液體，用 PBS 沖洗細胞 3×5 分鐘。

8.細胞與二抗在 1% BSA 中孵育，室溫 1 小時，避光。

9.棄去二抗溶液，并用 PBS 沖洗細胞 3×5 分鐘，避光。

復染

10.在 0.1-1μg/ml Hoechst 或 DAPI（DNA 染色劑）中孵育細胞 1 分鐘。

11.PBS 沖洗。

封固

12.向蓋玻片上滴加一滴封固液封固。

13.用指甲油密封蓋玻片防止變干并移至顯微鏡下觀察。

14.-20°C 或 +4°C 避光保存。