免疫組織化學(xué) (IHC) 是確定組織切片上蛋白的存在與否及存在位置的一種方法。盡管這種方法在定量分析時(shí)靈敏度較免疫印跡法或 ELISA 等 免疫測(cè)定方法低，但是它能觀察到整個(gè)組織的情況。適用于評(píng)估癌癥等疾病的發(fā)展及治療情況。因此，從 IHC 獲得的信息結(jié)合顯微技術(shù)提供 了一副“宏圖”，使來(lái)自其它方法的數(shù)據(jù)有據(jù)可依。

免疫組織化學(xué)染色是抗體識(shí)別靶抗原的過(guò)程。因?yàn)榭贵w是高度特異的，因此它只與組織切片上相應(yīng)的蛋白結(jié)合。應(yīng)用顯色檢測(cè)法即能看到抗 原-抗體反應(yīng)，一種顯色方法是將與酶結(jié)合的抗體作為底物在蛋白位點(diǎn)產(chǎn)生一種色素沉著，另外一種方法是熒光檢測(cè)法，即將熒光染料結(jié)合到 抗體上，應(yīng)用熒光顯微技術(shù)檢測(cè)。

IHC-P 涉及到固定（通常在中性甲醛溶液中固定）組織的染色，然后是在切割之前的石蠟包埋。下面是 IHC-P 技術(shù)的基本步驟：

1.組織的固定和包埋

2.切割并封固切片

3.脫蠟復(fù)水

4.抗原修復(fù)

5.免疫組織化學(xué)染色

6.復(fù)染（如果需要）

7.脫水并用封固劑封固

8.顯微鏡下觀察染色

目錄

優(yōu)化 IHC-P 新抗體

1.抗原修復(fù)

2.一抗?jié)舛?/p>

3.檢測(cè)

固定

脫蠟

抗原修復(fù)

1.熱誘導(dǎo)抗原表位修復(fù)的緩沖溶液

2.熱誘導(dǎo)抗原表位修復(fù)方法

3.具有酶活性抗原的修復(fù)

免疫組織化學(xué)染色和檢測(cè)實(shí)驗(yàn)方案

1.一般指南

2.手冊(cè)

3.對(duì)照

4.信號(hào)放大

相關(guān)資料

優(yōu)化 IHC-P 新抗體

一種新抗體要應(yīng)用到 IHC-P 中，就必須找到適宜這種抗體的染色條件。每種抗原都有一個(gè)最佳修復(fù)方法。每種抗體都有一個(gè)最佳稀釋濃度。

抗原修復(fù)

試著在沒(méi)有抗原修復(fù)和應(yīng)用下列抗原修復(fù)方法修復(fù)抗原的情況下染色，詳細(xì)操作見抗原修復(fù)部分（第 30 頁(yè)）。

1.熱修復(fù)：枸櫞酸鈉 10 mM，pH 6.0

2.熱修復(fù)：Tris/EDTA pH 9.0

3.酶解：胰蛋白酶、胃蛋白酶或其它蛋白酶。

抗原修復(fù)的最佳方法確定后，就可以進(jìn)行最佳抗體濃度的確定了。

一抗?jié)舛?/strong>

如果抗體濃度未知，我們建議用 0.5 μg/ml 和 5 μg/ml 4°C 過(guò)夜。如果抗體未經(jīng)純化，我們建議開始時(shí)使用下面的初始稀釋度，也可以嘗試 20 倍的高倍稀釋度。

1.全抗血清：1/50

2.腹腔積液：1/100

3.組織培養(yǎng)上清：不稀釋（也指“neat”）

檢測(cè)

我們建議使用辣根過(guò)氧化物酶 (HRP)，在光學(xué)顯微鏡下觀察。過(guò)氧化物/DAB 作為底物和色素原。熒光顯微鏡方法中有多種熒光

染料標(biāo)記的 抗體，具體用哪一種要根據(jù)試驗(yàn)需要來(lái)進(jìn)行選擇。

固定

正確的固定是免疫組織化學(xué)方法的關(guān)鍵。最常用的是 10% 中性甲醛溶液 (NBF)。Abcam 說(shuō)明書推薦 IHC-P 使用該固定劑，除非另有說(shuō)明。 其它不常用的固定劑如多聚甲醛 (PFA) 或 Bouin's 液（甲醛/苦味酸）等。這些固定劑的配方詳見緩沖液部分，第71頁(yè)。

理想的固定時(shí)間取決于組織塊的大小和類型。對(duì)于大多數(shù)組織來(lái)說(shuō)，通常固定時(shí)間在 18-24 小時(shí)之間較為理想。固定不足會(huì)導(dǎo)致組織切片因 邊緣染色而信號(hào)強(qiáng)，中間未染上而無(wú)信號(hào)。固定過(guò)度將會(huì)屏蔽抗原表位。抗原修復(fù)有助于克服屏蔽作用，但是如果固定時(shí)間太長(zhǎng)（比如一個(gè) 星期）那么抗原修復(fù)也無(wú)濟(jì)于事。

固定后，將組織塊包埋于石蠟中，用切片機(jī)切成理想厚度（依據(jù)組織一般大約在 5-20 微米），然后將切片附著在玻片上，封固最好用正電荷吸 附或 3-氨基-丙酯-三-乙氧基-硅烷 (APES)，室溫過(guò)夜脫水并徹底干燥。如果切片不能很好的附著在玻片上，可以將其至于 60°C 放置數(shù)小時(shí)。

脫蠟

在開始染色之前，切片必須先脫蠟至水。脫蠟不徹底，就會(huì)使切片很難染上色。

材料及試劑

二甲苯

無(wú)水乙醇

95% 乙醇

方法

將切片置于架子上，依據(jù)下列方法沖洗：

1.二甲苯：2 X 3 分鐘

2.二甲苯與無(wú)水乙醇 1:1 混勻：3 分鐘

3.無(wú)水乙醇：2 X 3 分鐘

4.95% 乙醇：3 分鐘

5.70 %乙醇：3 分鐘

6.50 % 乙醇:：3 分鐘

7.冷的自來(lái)水小水流沖洗

在開始抗原修復(fù)前確保切片一直浸沒(méi)在水中以防變干，否則特異抗體不易結(jié)合且會(huì)有很高的染色背景。

抗原修復(fù)

大多數(shù)甲醛固定的組織在開始染色之前都需要先修復(fù)抗原，這是由于在固定過(guò)程中產(chǎn)生了亞甲基橋使蛋白之間交聯(lián)屏蔽了抗原位點(diǎn)。兩種抗 原修復(fù)方法為熱修復(fù)法（稱之為熱誘導(dǎo)抗原表位修復(fù)或 HIER）和酶解法。

這些修復(fù)方法原理都是將亞甲基橋打斷，使抗原表位暴露出來(lái)，以便于抗體結(jié)合。有的抗原適合酶解修復(fù)，有的抗原適合熱修復(fù)。酶解修復(fù) 有時(shí)會(huì)損壞組織的形態(tài)結(jié)構(gòu)，因此需要摸索酶濃度和作用時(shí)間。Tris/EDTA pH 9.0 的緩沖液適合于大多數(shù)抗原，pH 6.0 的枸櫞酸鈉緩沖液也 較為常用。以下網(wǎng)站解釋了為什么 Abcam 建議首選 Tris/EDTA pH 9.0 的緩沖液而不是 pH 6.0 的枸櫞酸鈉緩沖液。

熱抗原修復(fù)需要高壓鍋、微波爐或蒸煮鍋。另外，一些實(shí)驗(yàn)室將玻片置于修復(fù)溶液中 60°C 水浴過(guò)夜。除非抗原修復(fù)方法在抗體數(shù)據(jù)表中可 以找到，否則必須通過(guò)實(shí)驗(yàn)來(lái)確定適宜的修復(fù)。Abcam建議嘗試多種方法來(lái)確定適宜的修復(fù)方法，以便于獲得理想的染色。

1.熱修復(fù)緩沖溶液

下面是三種HIER較為常用的緩沖溶液，對(duì)于一個(gè)特定的抗體，在沒(méi)有其他研究者建議的情況下，要通過(guò)實(shí)驗(yàn)確定選用哪種修復(fù)緩沖液。

1.枸櫞酸鈉緩沖液 (10 mM Sodium Citrate, 0.05% 吐溫- 20, pH 6.0)

2.1 mM EDTA, 調(diào)至 pH 8.0

3.Tris/EDTA 緩沖液 (10mM Tris, 1 mM EDTA 溶液, 0.05% 吐溫-20, pH 9.0)

熱修復(fù)法

a) 高壓蒸汽法

玻片要置于金屬架上

材料及試劑

家用不銹鋼高壓鍋

加熱板

玻片架放置容器（容量大約 400-500ml）

抗原修復(fù)緩沖液（如 Tris/EDTA pH 9.0，枸櫞酸鈉 pH 6.0）

方法

1.將合適的抗原修復(fù)緩沖液加入高壓鍋內(nèi)，然后將鍋置于加熱板并開至最大功率，此時(shí)不要把蓋子蓋緊。在等待煮沸過(guò)程中，按前面描述進(jìn) 行脫蠟至水。

2.煮沸后，將玻片從自來(lái)水中取出放入高壓鍋內(nèi)。小心熱溶液 - 使用鑷子。依照說(shuō)明書加上加壓閥。

3.高壓鍋達(dá)到最大壓力后（見操作手冊(cè)），維持 3 分鐘（見注意事項(xiàng) 1）。

4.3 分鐘過(guò)后，關(guān)掉加熱板，將高壓鍋取下放置。

5.打開高壓鍋閥門（見操作手冊(cè)），冷水冷卻鍋身。壓力降下后，打開鍋蓋，冷水冷卻 10 分鐘。小心熱溶液使用注意事項(xiàng)（見注意事項(xiàng) 2)。

6.參照手冊(cè)繼續(xù)染色。

注意事項(xiàng)：

1.3 分鐘只是抗原修復(fù)的建議時(shí)間。低于 3 分鐘可能會(huì)使修復(fù)不徹底，導(dǎo)致染色較弱。而超過(guò) 3 分鐘可能會(huì)使修復(fù)過(guò)度，導(dǎo)致非特異性背景 染色，同時(shí)增加切片離解的幾率。因此需要做對(duì)照試驗(yàn)，同樣的組織切片分別修復(fù) 1、2、3、4、5 分鐘后開始染色，針對(duì)所用的特異抗 體選擇最佳修復(fù)時(shí)間。

2.確保玻片徹底冷卻可以便于下一步操作，而且使抗原表位在經(jīng)歷高溫后復(fù)原。

b) 微波法

不建議使用家用微波爐。因?yàn)樗鼤?huì)導(dǎo)致抗原修復(fù)時(shí)冷熱不均。而且由于沒(méi)有高壓環(huán)境，修復(fù)時(shí)間較長(zhǎng)，會(huì)使切片解離。建議使用科研專用微 波爐較為合適。大多品牌的科研專用微波爐都有加壓裝置，能持續(xù)保持 98°C 從而避免切片解離。唯一的缺陷就是它的價(jià)格昂貴。

使用該方法時(shí)，修復(fù)緩沖液煮沸會(huì)大量蒸發(fā)，要確保緩沖液的量，不能使切片變干。

玻片要置于塑料架子和塑料容器內(nèi)，玻璃架和玻璃容器在加熱時(shí)會(huì)破裂。

材料和試劑

家用 (850W) 或科研專用微波爐

微波爐專用玻片放置架及容器（容量大約 400-500ml）或染色缸

抗原修復(fù)緩沖液（如 Tris/EDTA pH 9.0，枸櫞酸鈉溶液 pH 6.0，等等）

方法

1.按前面描述將切片脫蠟至水。

2.向微波爐專用容器中加入合適的修復(fù)緩沖液（見注意事項(xiàng) 1）

3.從自來(lái)水中取出切片并放入容器中，置于微波爐內(nèi)。如果用家用微波爐，就將之開到最大功率至開始沸騰并煮沸 20 分鐘。如

果采用科研 專用微波爐，就將溫度設(shè)置在 98°C 維持 20 分鐘以修復(fù)抗原（見注意事項(xiàng) 2）。

4.20 分鐘后，取出容器放置水中冷卻 10 分鐘。小心熱溶液（見注意事項(xiàng) 3）。

5.參照手冊(cè)繼續(xù)染色。

注意事項(xiàng)

1.使用非密封的容器，要確保修復(fù)緩沖液足以浸沒(méi)切片幾厘米，防止在煮沸過(guò)程中切片變干。

2.20 分鐘只是抗原修復(fù)的建議時(shí)間。低于 20 分鐘可能會(huì)使修復(fù)不徹底，導(dǎo)致染色較弱。而超過(guò) 20 分鐘可能會(huì)使修復(fù)過(guò)度，導(dǎo)致非特異性 的背景染色，同時(shí)會(huì)增加組織切片從玻片上解離的幾率。因此需要做對(duì)照試驗(yàn)，同樣的組織切片分別修復(fù) 5、10、15、20、25、30 分鐘 后開始染色，針對(duì)特異抗體選擇最佳修復(fù)時(shí)間。

3.確保玻片徹底冷卻可以便于下一部操作，而且使抗原表位在經(jīng)歷高溫后復(fù)原。

c) 蒸煮鍋法

許多實(shí)驗(yàn)室使用蒸煮鍋或電飯煲加熱。此方法與微波法相似，都是將緩沖液溫度維持在 100°C，不同之處在于沸騰時(shí)此方法沒(méi)有微波法反應(yīng) 激烈。該方法也可用 100°C 水浴代替。

玻片要置于塑料或金屬架子容器內(nèi)，玻璃架和玻璃容器在加熱時(shí)會(huì)破裂。

材料和試劑

蒸煮鍋

玻片放置架及容器（容量大約 400-500ml，如果采用 Tissue –Tek 容器大約 250ml）

抗原修復(fù)緩沖液（如 Tris/EDTA pH 9.0，枸櫞酸鈉溶液 pH 6.0，等等）

方法

1.按前面描述將切片脫蠟至水。

2.依據(jù)用戶手冊(cè)設(shè)置蒸煮鍋并預(yù)熱。

3.在燒瓶中加熱適量修復(fù)緩沖液并煮沸（用微波爐加熱會(huì)更方便）。

4.將盛放玻片架的容器放置蒸煮鍋中。

5.將熱修復(fù)緩沖液小心加到容器中，然后放入玻片架。也可以采用更簡(jiǎn)捷的操作，先向容器中加熱修復(fù)緩沖液再放入蒸煮鍋中。

6.加蓋。盛放緩沖液的容器也須配備蓋子。剛開始時(shí)玻片架可能會(huì)使修復(fù)溶液溫度降低，但幾分鐘內(nèi)會(huì)回升到 95-100°C 之間。

7.達(dá)到溫度后維持 20 分鐘。（見微波法注意事項(xiàng) 1）

8.20 分鐘后，取出容器放置水中冷卻 10 分鐘。熱溶液使用注意事項(xiàng)（見微波法注意事項(xiàng) 2)。

9.依據(jù)手冊(cè)開始組織染色。

3.酶解抗原修復(fù)法

依據(jù)抗體數(shù)據(jù)表中選擇需要的酶。如果沒(méi)有，那么胰蛋白酶適用于大多數(shù)福爾馬林/PFA 固定后需要修復(fù)的抗原。至少有兩種將酶溶液加到組織上的方法：直接用吸管將酶溶液滴加到玻片的組織上或?qū)⒔M織玻片放入酶溶液中。第一種方法反應(yīng)試劑需要量 少，但是因?yàn)槊總€(gè)玻片需要分別處理，較不容易保證孵育時(shí)間的一致。鑒于此，在處理大批量玻片（如數(shù)量>5）時(shí)，采用第二種方法較容易。 如果采用全自動(dòng)染色系統(tǒng)（如 Ventana），要查閱酶解修復(fù)操作指南。

a) 滴管法

材料和試劑

37°C 孵育箱

加濕器（恒溫箱自帶或在容器內(nèi)放入濕紙巾）

兩個(gè)盛 TBS 的玻片架容器（TBS 配方詳見緩沖液部分第 71 頁(yè)）

酶解抗原修復(fù)溶液（胰蛋白酶如下所述，胃蛋白酶和蛋白酶K見緩沖液部分第71頁(yè)）

下面介紹一下胰蛋白酶法。有市售已優(yōu)化的 IHC 用胰蛋白酶產(chǎn)品(Abcam，貨號(hào) ID ab970)，也可以按照第 11 章 71 頁(yè)緩沖液部分制備。

方法

1.將胰蛋白酶預(yù)熱至 37°C。小心的將組織切片周圍的水吸干，然后吸取酶溶液滴加到切片上（一般 50-100μl 即可）。用吸管尖端將酶溶液 鋪蓋住整個(gè)切片，注意不要弄壞組織。

2.將玻片置于加濕器內(nèi)，然后 37°C 孵育。避免直接將玻片放入恒溫箱架子上，否則會(huì)因溫度不均影響染色質(zhì)量。盛放玻片的容

器最好先預(yù) 熱再放入恒溫箱內(nèi)。

3.10-20 分鐘（需要優(yōu)化）后，取出玻片，流水沖洗 3 分鐘。

4.參照手冊(cè)繼續(xù)染色。

b) 浸泡法

材料和試劑

37°C 水浴

玻片架及玻片架容器

酶解抗原修復(fù)溶液（胰蛋白酶見滴加作用液法，胃蛋白酶和蛋白酶 K 見緩沖液部分第 71 頁(yè)）

方法

1.將水浴溫度設(shè)置為酶最適宜的溫度。向盛放玻片架的兩個(gè)容器中加入超純水。容器放入水浴中加熱。（見注意事項(xiàng) 2）

2.按上述方法將切片脫蠟至水后放入水浴箱其中一個(gè)容器中加熱。（見注意事項(xiàng) 3）

3.用水浴箱中另一個(gè)容器中的熱水制備酶解抗原修復(fù)緩沖液，然后將盛有緩沖液的容器放回水浴箱中重新加熱。（見注意事項(xiàng) 4）

4.將加熱過(guò)的玻片放入酶溶液中 10-20 分鐘（見注意事項(xiàng) 5）并間歇緩慢震蕩。取出玻片在流水下沖洗3分鐘，將酶漂洗干凈。

5.參照手冊(cè)繼續(xù)染色。

注意事項(xiàng)

1.仔細(xì)閱讀酶使用手冊(cè)，因?yàn)橛行┟感枰厥獾木彌_溶液和活性輔助因子。

2.水或緩沖液的體積要足夠沒(méi)過(guò)玻片。

3.若將冷玻片直接放入酶溶液中會(huì)使溶液溫度降低從而酶活性降低，導(dǎo)致抗原位點(diǎn)修復(fù)不徹底。

4.盡可能快的準(zhǔn)備出抗原修復(fù)緩沖液以避免妨礙酶活性的發(fā)揮。放入玻片之前使溶液達(dá)到需要的溫度。

5.10-20 分鐘只是孵育的建議時(shí)間。低于 10 分鐘可能會(huì)使修復(fù)不徹底，導(dǎo)致染色較弱。而超過(guò) 20 分鐘可能會(huì)使修復(fù)過(guò)度，導(dǎo)致非特異性背 景染色，增加切片從玻片上解離的幾率，損壞組織形態(tài)。因此需要先做對(duì)照試驗(yàn)，同樣的組織切片分別孵育 10、15、20、25、30 分鐘后 開始染色，針對(duì)特異抗體尋找到最佳修復(fù)時(shí)間。

免疫組織化學(xué)染色和檢測(cè)實(shí)驗(yàn)方案

1.一般原則

下面的操作適用于沒(méi)有全自動(dòng)染色機(jī)或 capillary gap system 等的實(shí)驗(yàn)室（如Shandon Sequenza）。可用吸管人工加試劑，該手冊(cè)也適用于 全自動(dòng)或半自動(dòng)系統(tǒng)。

培養(yǎng)箱應(yīng)配備有加濕器避免組織變干。變干發(fā)生在任何階段最后都會(huì)導(dǎo)致非特異性染色及高背景染色。帶密封蓋的淺塑料盒，底部鋪上濕紙 巾就是一個(gè)加濕裝置。玻片只要不貼聚紙巾且平放就不會(huì)變干，一個(gè)好的解決辦法就是，將一根塑料輸液管切割成若干適合恒溫箱的小段， 用膠兩個(gè)兩個(gè)的粘到恒溫箱底部，每對(duì)管之間間隔 4cm，這樣能給玻片一個(gè)平穩(wěn)及升起的小平臺(tái)，使玻片直接接觸濕紙巾。

一抗和二抗的最佳稀釋度可以從數(shù)據(jù)表中找到，或者通過(guò)試驗(yàn)獲得。根據(jù)所獲得的結(jié)果調(diào)節(jié)至最佳稀釋度。要嚴(yán)格遵照說(shuō)明書中的孵育時(shí)間。

酶解法中，辣根過(guò)氧化物酶 (HRP) 和堿性磷酸酶 (AP) 是最為常用的酶。這些酶有許多底物。

2.操作步驟

緩沖液配方，若需要可在開始下面操作之前先進(jìn)行抗原修復(fù)。

第一天

1.如使用 HRP 標(biāo)記二抗檢測(cè)，則需要封閉掉內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，但我們建議在開始一抗孵育前不予理會(huì)。

2.在含 0.025% Triton X-100 的 TBS 漂洗玻片 2 X 5 分鐘，輕輕震蕩。

3.用含 10% 正常血清、1% BSA 的 TBS 室溫封閉 2 小時(shí)。空干封閉液（不是漂洗），并用紙巾將玻片周圍擦干。

4.一抗用含 1% BSA 的 TBS 稀釋后加到玻片上。

5.4°C 孵育過(guò)夜。

第二天

1.用含 0.025% Triton X-100 的 TBS 漂洗 2 X 5 分鐘，并輕輕震蕩。

2.如使用 HRP 標(biāo)記二抗檢測(cè)，則需將玻片在含 0.3% H2O2 的 TBS 中孵育 15 分鐘 以封閉內(nèi)源性過(guò)氧化物酶。

3.酶法檢測(cè)（HRP 或 AP 標(biāo)記二抗）：

參照廠家推薦的稀釋度，用含 1% BSA 的 TBS 稀釋酶標(biāo)二抗，加到玻片上后室溫孵育 1 小時(shí)。

熒光檢測(cè)：

參照廠家推薦的稀釋度，用含 1% BSA 的 TBS 稀釋熒光標(biāo)記的二抗，加到玻片上后室溫孵育 1 小時(shí)。此步應(yīng)在暗處進(jìn)行，防止熒光衰退。

4.在 TBS 中漂洗 3 X 5 分鐘。

如采用熒光檢測(cè)，則結(jié)束此步后就可以用封固劑和蓋玻片進(jìn)行封固了。

如采用底物顯色，則還需繼續(xù)進(jìn)行下述操作。

5.室溫下與底物作用 10 分鐘。

6.流水沖洗 5 分鐘。

7.復(fù)染（如果需要）。

8.脫水，擦干并封固。

3.對(duì)照

為了評(píng)價(jià)非特異性交叉反應(yīng)和 Fc 受體結(jié)合的影響，與一抗同型但不相關(guān)的抗體（如 BrdU）將來(lái)用做對(duì)照。與不相關(guān)抗原結(jié)合的抗體稱為同 型對(duì)照。對(duì)于全血清抗體而言，對(duì)照抗體是來(lái)源于同種動(dòng)物的未免疫正常血清。

如果沒(méi)有同型對(duì)照，陰性對(duì)照也可，就是用抗體稀釋液代替一抗。強(qiáng)力推薦陽(yáng)性組織對(duì)照，確保抗體達(dá)到預(yù)期效果。根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要，也可設(shè) 陰性組織對(duì)照，在該組織中應(yīng)沒(méi)有目標(biāo)蛋白存在的。

使用含 0.025% Triton X-100 的 TBS 有助于降低表面張力，從而使反應(yīng)試劑能更易覆蓋住整個(gè)組織切片。

同時(shí)也能融解 Fc 受體從而減少非特異結(jié)合。Abcam 推薦使用 TBS，它比 PBS 的背景染色更干凈。

注意事項(xiàng)：

1.二抗可能會(huì)與組織內(nèi)的內(nèi)源性免疫球蛋白發(fā)生交叉反應(yīng)。以二抗同種動(dòng)物來(lái)源的正常血清預(yù)處理組織，可減少這種作用。加一抗前先與正 常血清孵育從而消除 Fc 受體與一抗和二抗結(jié)合。抗體稀釋緩沖液中的 BSA 能降低疏水作用引起的非特異結(jié)合。

如果組織樣品經(jīng)醛類如甲醛、多聚甲醛、戊二醛等固定后用免疫熒光法 (IF) 檢測(cè)，在加一抗之前要用含 0.3M 甘氨酸的封閉液封閉。因?yàn)楦?氨酸能結(jié)合自由醛基，否則這些醛基會(huì)與一抗和二抗結(jié)合造成高背景染色。使用多聚甲醛或戊二醛固定時(shí)，由自由醛基導(dǎo)致的高背景很有 可能發(fā)生。

2.一抗應(yīng)稀釋到廠家推薦的最佳稀釋度或者曾經(jīng)篩選到的最佳稀釋度。如果沒(méi)有起始稀釋倍數(shù)，我們建議按下述操作。大多數(shù) IHC-P用抗體 的使用濃度在 0.5-10μg/ml 之間。要確保一抗和被染色的組織來(lái)自不同物種。例如，小鼠組織，一抗來(lái)自小鼠，抗鼠 IgG二抗會(huì)與小鼠組 織中的所有內(nèi)源性 IgG 結(jié)合，導(dǎo)致高背景染色。將小鼠單克隆抗體用于小鼠組織將在我們小鼠-對(duì)-小鼠部分中討論。

3.過(guò)夜孵育可以使低親和力的抗體有較長(zhǎng)的時(shí)間結(jié)合到抗原上。然而，不管抗體親和力的高低，一旦抗原抗體結(jié)合達(dá)到飽和或平衡，就不會(huì) 再發(fā)生結(jié)合。因此，過(guò)夜孵育確保了結(jié)合達(dá)到平衡。

4.過(guò)氧化氫 (H2O2) 能抑制內(nèi)源性過(guò)氧化物酶活性從而降低背景染色。檢測(cè)是否存在內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，在 DAB (3,3’二氨基鄰苯胺底物)溶液 中水解后孵育組織玻片。如果切片在顯微鏡下出現(xiàn)棕色區(qū)域，說(shuō)明存在過(guò)氧化物酶，因此應(yīng)該做封閉。一些表位被過(guò)氧化物修飾了，降低 了抗原抗體的結(jié)合。初步孵育后再將切片與過(guò)氧化物孵育就能避免此問(wèn)題。

用 TBS 或水稀釋過(guò)氧化氫。有些實(shí)驗(yàn)室用甲醇稀釋，甲醇更適合于血涂片或其它富含過(guò)氧化物酶的組織如肝臟。甲醇稀釋過(guò)氧化氫可減 少水溶液對(duì)組織的損壞。對(duì)于其它組織，我們建議使用 TBS 或水。甲醇/過(guò)氧化物孵育后會(huì)降低一些抗原抗體的結(jié)合，特別是對(duì)于細(xì)胞表 面蛋白來(lái)說(shuō)。內(nèi)源性過(guò)氧化物酶的封閉只用于過(guò)氧化物酶標(biāo)記物如 HRP。

5.酶聯(lián)底物產(chǎn)生有色沉著。最終產(chǎn)生什么樣的有色沉著取決于用什么酶標(biāo)簽以及采用水溶性封片劑還是有機(jī)溶劑封片劑。下面所列的是一些 常用底物：

6.觀察組織和細(xì)胞形態(tài)的復(fù)染劑通常是蘇木精（藍(lán)色）、核固紅或甲基綠。采用熒光檢測(cè)法時(shí)，復(fù)染用 DAPI（藍(lán)色）或碘化吡/PI（紅色）。

7.切記 DAB 是一種致癌物，操作時(shí)要穿上防護(hù)服。與次氯酸鈉在密封容器中過(guò)夜可弱化它的致癌作用（相互作用產(chǎn)生有害氣體），再根據(jù) 實(shí)驗(yàn)室操作規(guī)程處理。如果使用 AP，取 0.24mg/ml 的左旋四咪唑加到染料溶液中，來(lái)抑制內(nèi)源性磷酸酶的活性從而降低背景染色。

8.如果使用AEC、固紅、INT 或其它水溶性染料，切記它們?nèi)苡诖碱惾軇┲小Ｒx用合適的水溶性封片劑。切勿進(jìn)行下述步驟 9中的脫水擦干。

9.通過(guò)再水化使切片脫水并擦干其上的 DAB、新品紅、NBT、TVega 紅、NBT 或其它有機(jī)染料。按照再水化操作步驟的反向操作。

10.將玻片置于 50% 乙醇中 3 分鐘。

11.70% 乙醇 3 分鐘。

12.95% 乙醇 3 分鐘。

13.100% 乙醇 3 分鐘。

14.二甲苯與無(wú)水乙醇 1:1 混合液 3 分鐘。

15.二甲苯 2 X 3 分鐘。

在適當(dāng)?shù)挠袡C(jī)封固液中封固切片。在有機(jī)封固液中封固切片比在水溶性封固液中封固得到的折射率更好。在顯微鏡下看到的圖像更

清晰明顯。

4.信號(hào)放大

為得到一個(gè)較強(qiáng)的信號(hào)，有多種策略可以添加更多的酶或熒光染料。

a) 親和素—生物素（ABC）

該技術(shù)是由 Su-Ming Hsu 及其同事 (J Histochem Cytochem. 1981 Apr 29 (4):577-80) 共同建立的。親和素是在雞蛋白中發(fā)現(xiàn)的，親和力高 ，有4個(gè)不可逆的生物素結(jié)合位點(diǎn)，并且這種結(jié)合是不可逆的。生物素是羧基化反應(yīng)中酶的輔助因子。

簡(jiǎn)言之，先將一抗結(jié)合到靶蛋白上，再將生物素標(biāo)記二抗結(jié)合到一抗上。另一反應(yīng)系統(tǒng)中，將親和素與生物素化的酶按一定比例混合形成親和素—生物素—酶復(fù)合物，使親和素上保留一定的未結(jié)合位點(diǎn)。切片與抗體孵育后再與此復(fù)合物共同孵育，使復(fù)合物親和素上未結(jié)合位點(diǎn)與 生物素化的二抗結(jié)合，相比較酶標(biāo)二抗或一抗而言可以使更多的酶接觸到底物。

親和素—生物素復(fù)合物有市售的試劑盒，提供有兩種試劑及結(jié)合最佳比例的操作說(shuō)明。該復(fù)合物適用于 Abcam 的任何生物素化的抗體。如果組織中存在有內(nèi)源性的生物素，如腎臟、肝臟、大腦、前列腺、結(jié)腸、腸、睪丸等會(huì)與親和素—生物素復(fù)合物結(jié)合導(dǎo)致背景染色 (Wang and Pevsner, Cell Tissue Res. 1999 Jun;296(3):511-6.)。Abcam提供有抑制這種結(jié)合的試劑盒，產(chǎn)品編號(hào)是 ab3387。

b) 標(biāo)記的鏈霉生物素 (LSAB)

該方法同 ABC 法相似，它利用了鏈霉親和素（親和力與卵白素相似）和生物素之間的相互作用。一抗與生物素標(biāo)記的抗 Ig 二抗結(jié)合后，再 與結(jié)合在酶或熒光染料上的鏈霉親和素結(jié)合。Abcam 提供有鏈霉親和素 — HRP 結(jié)合物，產(chǎn)品編號(hào)是 ab7403。

應(yīng)用鏈霉親和素代替生物素可以減少非特異性背景染色，因?yàn)殒溍褂H和素是非糖基化的，（卵白素不是），因此它不會(huì)與凝集素或其它糖結(jié) 合蛋白反應(yīng)。而且 LSAB 法比 ABC 法靈敏 4—8 倍（詳見 Giorno R, Diagno Immunol. 1984;2(3):161-6）。

c) HRP 聚合物

將二抗與聚合物-酶復(fù)合物結(jié)合形成的新型聚合物-酶-抗體產(chǎn)物（如抗鼠和/或兔 IgG）優(yōu)于卵白素—生物素 (ABC) 和標(biāo)記的鏈霉生物素 (LSAB)。 因?yàn)榇朔N方法比上述兩種方法減少一步，從而免除了內(nèi)源性生物素的干擾。Abcam 提供有羊抗兔/鼠 IgG HRP 多聚物，產(chǎn)品編號(hào)是 ab2891。

d) 直接酪胺信號(hào)放大法 (TSE)

信號(hào)擴(kuò)大最有效的方法之一是 TSE，受專利保護(hù)（又稱 TSA 或 CSA，不同廠家的試劑盒標(biāo)示不一樣），特別適用于其它檢測(cè)系統(tǒng)難以檢測(cè) 到的相對(duì)稀少的抗原，并且可以增強(qiáng)結(jié)合力弱的抗體的反應(yīng)結(jié)果。

此方法是一抗和 HRP 標(biāo)記二抗結(jié)合后利用過(guò)氧化物酶的催化作用，使酪胺蛋白中酪胺部分與抗體共價(jià)結(jié)合。即使在處理玻片清洗抗體時(shí)， 共價(jià)結(jié)合的蛋白也不會(huì)被洗掉，因?yàn)槔野锋I是共價(jià)的。將酶或熒光染料標(biāo)記抗體直接結(jié)合到酪胺蛋白結(jié)合物的蛋白部分，就可以獲得信號(hào)。 市售的試劑盒中蛋白是生物素，應(yīng)用的是鏈霉親和素標(biāo)記酶而不是抗體結(jié)合物。此方法的缺點(diǎn)是試劑盒昂貴，且步驟多時(shí)間長(zhǎng)。