IHC/ICC 中的固定和通透技術(shù)

固定：

固定就是保持抗原細(xì)胞和亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)固定不動(dòng)，同時(shí)又能使抗體進(jìn)入到細(xì)胞和亞細(xì)胞的所有部位。固定和通透方法的選擇取決于抗原表位和 抗體本身的靈敏性，有時(shí)需要優(yōu)化。

固定時(shí)可使用一些交聯(lián)試劑，如多聚甲醛，有利于保護(hù)細(xì)胞結(jié)構(gòu)，但是可能會(huì)降低一些細(xì)胞成分的抗原性，因?yàn)榻宦?lián)阻礙了抗體結(jié)合。鑒于 此，可采用抗原修復(fù)技術(shù)，尤其是固定孵育時(shí)間較長(zhǎng)時(shí)或使用高百分比的交聯(lián)度固定劑時(shí)。另外一種選擇就是使用有機(jī)溶劑，但是它們會(huì)吸 去脂類(lèi)使細(xì)胞脫水，同時(shí)會(huì)使蛋白沉淀在細(xì)胞架上。

1.4% 多聚甲醛

向玻片滴加 4% 多聚甲醛，維持 10 分鐘。

用 PBS 或含 1%BSA 的 PBS 沖洗細(xì)胞。

(注意：在多聚甲醛中固定時(shí)間超過(guò) 10-15 分鐘會(huì)造成蛋白交聯(lián)，或許需要通過(guò)抗原修復(fù)技術(shù)來(lái)修復(fù)此交聯(lián)位點(diǎn)，

以確保抗體能自由結(jié)合并檢測(cè)到該蛋白。）

2.乙醇

向玻片滴加 100-200μl 預(yù)冷的 95% 乙醇，5% 冰醋酸，維持 5-10 分鐘。

用 PBS 或含 1%BSA 的 PBS 沖洗細(xì)胞。

3.甲醇

向玻片滴加 100-200μl 的冷甲醇。 -20°C 維持 10 分鐘。

用 PBS 或含 1%BSA 的 PBS 沖洗細(xì)胞。

（注意：甲醇有通透作用。一些抗原表位對(duì)甲醇非常敏感，能破壞抗原表位結(jié)構(gòu)。因此，如果需要通透，可用丙酮代替甲醇。）

4.丙酮

向玻片滴加 100-200 μl 的冷丙酮。 -20°C 維持 5-10 分鐘。

用 PBS 或含 1%BSA 的 PBS 沖洗細(xì)胞。

（注意：丙酮也有通透作用，因此，不需要進(jìn)一步通透。)

通透：

通透技術(shù)僅用于抗體需進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)檢測(cè)蛋白時(shí)，包括細(xì)胞內(nèi)蛋白和抗原表位位于胞內(nèi)區(qū)的跨膜蛋白檢測(cè)。

溶劑：

1.丙酮固定也有通透作用。

2.甲醇固定也可通透，但不是總適用。

這些反應(yīng)試劑都可用來(lái)固定和通透，也可在交聯(lián)劑如多聚甲醛固定后再使用。

去污劑：

1.Triton 或 NP-40

含 0.1-0.2% Triton 或 NP-40 的 PBS 洗滌 10 分鐘。

這些去污劑同樣也能溶解部分核膜，因此非常適合于核抗原染色。

(注意：因?yàn)檫@些都是強(qiáng)去污劑，因此當(dāng)使用濃度較高或作用時(shí)間較長(zhǎng)時(shí)會(huì)破壞蛋白，影響染色效果）

2.吐溫-20，皂角苷，洋地黃皂苷和 Leucoperm。

用0.2-0.5% 洗滌 10-30 分鐘。

這些是較溫和的細(xì)胞膜溶劑。它們會(huì)使細(xì)胞膜產(chǎn)生足夠大的孔，促使抗體進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)而不用溶解胞膜。適合于胞漿內(nèi)抗原質(zhì)膜的

胞漿表面抗 原和可溶的核抗原。

特別建議：

用丙酮、乙醇或甲醛（高濃度）固定細(xì)胞骨架、病毒和一些酶抗原，可獲得理想的結(jié)果。

位于細(xì)胞器和胞漿顆粒上的抗原，其固定和通透方法的選擇取決于抗原本身，需盡量保留表位。