選擇合適的微珠，匯總表

Key: +++ = Strong binding, ++ = Medium binding, + = Weak binding, - = No binding

參考資料

Harlow, Ed, and David Lane. Using Antibodies. Cold Spring Harbor, New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999.Bonifacino, Juan S. et al. Current Protocols in Immunology 8.3.1-8.3.28, New York: John Wiley, 2001.

使抗體與微珠交聯(lián)的步驟：

降低洗脫蛋白質(zhì)溶液中污染的抗體數(shù)量：

為了使洗脫蛋白較少污染抗體，也為了更純凈蛋白質(zhì)的制備和干凈的免疫印跡實驗，推薦將抗體與珠子交聯(lián)。下面是一個實驗程序舉例（幾個網(wǎng)站有關(guān)于這個程序有很多信息）。目標蛋白應(yīng)該用溫和的洗脫液洗脫，如甘氨酸緩沖液。更詳細的緩沖液配方可在緩沖液章節(jié)找到，第71頁。

試劑：

交聯(lián)試劑：

鄰苯二甲酸二甲酯（DMP）

儲液濃度13mg/ml

洗脫試劑：

1M 甘氨酸（加濃鹽酸調(diào)整pH 值至3）

稀釋緩沖液：

PBS+ 1mg BSA 每1ml PBS

洗滌緩沖液：

含0.2M 三乙醇胺的PBS（每100ml 緩沖液中含3.04ml 三乙醇胺）

淬滅緩沖液：

含50mM 乙醇胺的PBS（311.7μl/100ml）

準備工作：

1.珠子用PBS 洗2 次。最終濃度為50％ 珠漿。

2. PBS 混合均勻并4°C 旋轉(zhuǎn)過夜。

交聯(lián)：

1.微量離心機（14000rpm 1分鐘）離心沉淀以洗滌珠顆粒。吸出PBS 上清液。

2. 1:1 比例加入稀釋緩沖液，輕輕混合并4°C 旋轉(zhuǎn)10 分鐘。微型離心機離心并如上吸出/摒棄上清。

3. 按需要的濃度用抗體稀釋緩沖液準備抗體溶液（參見抗體說明書的建議濃度）。1:1 比例將抗體加入，輕輕混合并4°C 旋轉(zhuǎn)1 小時。

4. 離心并吸出/摒棄上清。

5. 1:1 的比例將稀釋緩沖液加入，4°C 旋轉(zhuǎn)5 分鐘。離心并吸出/摒棄上清液。

6. 1:1 的比例將PBS 加入，離心并吸出/摒棄上清液。

7.交聯(lián)：

用1ml 洗滌緩沖液，溶解1ml 準備好的13mg/ml DMP 儲液。迅速漩渦震蕩混合。1:1 的比例將DMP 溶液加入，室溫（RT）旋轉(zhuǎn)30 分鐘。

（DMP 在水溶液中不穩(wěn)定。使用前快速配制。）

注意：您需要確認DMP 在加入珠子前后的pH 值均在8-9 之間（在此pH 值范圍以外，交聯(lián)效率將大大降低）。

用洗滌緩沖液洗滌珠子（室溫旋轉(zhuǎn)5 分鐘，離心并吸出/摒棄上清液）。

1:1 比例第二次加入DMP，室溫旋轉(zhuǎn)30 分鐘，按之前方法洗滌。

1:1 比例第三次加入DMP，室溫旋轉(zhuǎn)30 分鐘，按之前方法洗滌。

7. 淬滅和洗滌。

1:1比例加入淬滅緩沖液，室溫旋轉(zhuǎn)5 分鐘，離心并吸出/摒棄上清液；重復該步驟。用PBS 洗。

8. 去除多余的（未交聯(lián)）抗體：

用1M 甘氨酸（pH3）洗滌。室溫旋轉(zhuǎn)10 分鐘，離心并吸出/摒棄上清液；重復該步驟。

9. 存儲洗滌。

用免疫沉淀緩沖液洗滌（通常是PBS+吐溫）。室溫旋轉(zhuǎn)5 分鐘。洗三次，最后一次旋轉(zhuǎn)后保存。珠子可以在4°C 儲存幾天。可以加入0.02 - 0.05％ 疊氮鈉W/V 防止細菌生長。

免疫沉淀：

結(jié)合抗體的珠子現(xiàn)在可以進行如上常規(guī)IP 實驗流程。為了防止抗體與目標蛋白質(zhì)一起洗脫，用溫和的甘氨酸梯度洗脫（可到1M）。