一、裂解物的預(yù)清除程序

裂解物預(yù)清除可以幫助減少蛋白質(zhì)非特異性結(jié)合到agarose (瓊脂糖)或Sepharose beads (凝膠瓊脂糖珠)。用無(wú)關(guān)抗體或血清預(yù)清除，可去除蛋白質(zhì)與免疫球蛋白的非特異結(jié)合。最終實(shí)驗(yàn)結(jié)果背景降低并且信噪比提高。但是，如果最后蛋白質(zhì)是由免疫印跡實(shí)驗(yàn)檢測(cè)，預(yù)清除未必必要，除非是污染蛋白質(zhì)對(duì)目的蛋白質(zhì)產(chǎn)生明顯干擾。

1.加入50μl 同種動(dòng)物來(lái)源和型的無(wú)關(guān)抗體或正常血清作為免疫沉淀抗體（一些研究人員首選兔，參考Harlow and Lane，243 頁(yè)）到1ml 裂解物中，在冰上孵育1 小時(shí)。

2.加入100μl 珠漿。

3. 4°C 孵育10-30 分鐘并輕輕攪拌。

4. 微型離心機(jī)14000g 4°C 離心10 分鐘。

5. 丟棄珠子并保留上清進(jìn)行免疫沉淀。

為了提高收率，珠子可用裂解液洗滌1 或2 次以上，并將上清收集在一起。

重要的是要確保盡可能多的去除正常血清，這是因?yàn)樗鼤?huì)與特異抗體競(jìng)爭(zhēng)靶抗原。為了檢查這一點(diǎn)，可以做一個(gè)測(cè)試：用裂解緩沖液代替樣品，如上進(jìn)行所有預(yù)清除步驟。考馬斯藍(lán)染色的凝膠將顯示上清液中血清IgG 是否被有效去除。如果血清沒(méi)有得到充分去除，泳帶將出現(xiàn)在50 和25 kDa 處，這是重鏈和輕鏈，它的存在可能導(dǎo)致一個(gè)弱的免疫沉淀反應(yīng)。在預(yù)清除步驟，考慮降低血清量或增加與您的樣品孵育的珠子數(shù)量。

二、免疫沉淀

1.在冰上預(yù)冷離心管中加入10-50μg 含推薦量抗體的細(xì)胞裂解物。具體數(shù)量將根據(jù)蛋白質(zhì)的豐度和抗體與蛋白質(zhì)的親和力來(lái)選擇。

通常在預(yù)實(shí)驗(yàn)中，通過(guò)增加抗體的量沉淀固定數(shù)量的蛋白質(zhì)。

您可以查看抗體數(shù)據(jù)表獲得建議抗體的濃度。以下供參考使用：

1-5μl 多克隆抗體血清

1μg 親和純化的多克隆抗體

0.2-1μl 腹水（單克隆抗體）

20-100μl 培養(yǎng)液上清（單克隆抗體）

2. 樣品和抗體孵育的固定時(shí)間4°C 1-12 小時(shí)（過(guò)夜），最好輕輕振蕩或旋轉(zhuǎn)。孵育時(shí)間的長(zhǎng)短取決于蛋白質(zhì)的量和抗體的親和特性。

3. 同時(shí)準(zhǔn)備瓊脂糖珠子。如果使用單克隆抗體，選擇蛋白G 偶聯(lián)瓊脂糖珠子。如果使用多克隆抗體，蛋白A 偶聯(lián)瓊脂糖珠通常是適合的（請(qǐng)參閱“選擇蛋白珠”表9.5 下文）。如果買來(lái)的珠子是粉末，100mg 的珠子與1ml 0.1M PBS 孵育，洗1 小時(shí)后珠子膨脹起來(lái)，然后離心，去除上清。加入1ml 含0.1％ BSA (牛血清白蛋白) PBS，混合1 小時(shí)，PBS 洗滌2 次。去除上清并加入400μl 含蛋白酶抑制劑的緩沖液（可與裂解液相同）就可以使用了。它可以在4°C 儲(chǔ)存幾天；在含0.02％ 疊氮鈉的PBS 里會(huì)保存更長(zhǎng)時(shí)間（使用當(dāng)天用新鮮裂解液充分洗滌珠子）。您也可以購(gòu)買事先膨脹好的珠子直接使用。

(最好是用尖端切掉的移液吸頭，以防破壞珠子。IgM抗體：不要使用蛋白A或蛋白G結(jié)合珠子。使用山羊抗小鼠 IgM（或多價(jià)Ig 或抗重鏈）的珠子。)

4. 漿料混合好，向每個(gè)樣本中加入70-100μl。始終保持樣品在冰上。珠子將傾向于粘著吸頭，所以盡量減少珠子在吸管中運(yùn)動(dòng)并使用從尖端切斷5mm 的吸頭。

5. 裂解珠子混合液4°C 孵育4 小時(shí)并旋轉(zhuǎn)振蕩（最佳孵育時(shí)間可由預(yù)實(shí)驗(yàn)確定）。

6. 當(dāng)孵育結(jié)束后，管子離心，去除上清液并用細(xì)胞裂解液洗滌珠子3 次（每次4°C 離心去除上清）。

7. 最后，去除最后一次上清并加入25-50μl 2×上樣緩沖液。95-100°C 煮沸5 分鐘，以變性蛋白質(zhì)并將其與蛋白- A /G 珠子分離，隨后離心并保持上清含有蛋白質(zhì)。然后，您可以凍存樣品或進(jìn)行SDS – PAGE 電泳。

使用上樣緩沖液是最苛刻的洗脫方法，也將洗脫任何非共價(jià)結(jié)合的抗體和抗體片段，這將顯示在免疫印跡膠中。抗原可用溫和的甘氨酸梯度洗脫（高達(dá)1M），以減少抗體洗脫量。