實(shí)驗(yàn)室常用 DNA 聚合酶有三種： TaKaRa TaqTM，TaKaRa EXTaqTM 和Pyrobest TMDNA Polymerase。TaKaRa TaqTM 是一般的 DNA 聚合酶，保真性較差 ，但價(jià)錢便宜，一般用于基因表達(dá)的檢測(cè)等。TaKaRa EXTaqTM是具有 Proof reading活性的耐熱性 DNA 聚合酶，具有一定的保真性，而且其擴(kuò)增得到的 PCR 產(chǎn)物 3’端附有一個(gè) “A”堿基，如果希望直接將產(chǎn)物克隆 到 T-vector 可以用此酶。Pyrobest TM DNA Polymerase 也是具有 Proof reading 活性的耐熱性 DNA 聚合酶，其特點(diǎn)是保真性極高，擴(kuò)增得到的 PCR 產(chǎn)物為平滑末端。如果進(jìn)行基因的擴(kuò)增請(qǐng)使用此酶。

1.按下列組成在 PCR 反應(yīng)管中調(diào)制反應(yīng)液：TaKaRa TaqTM或 TaKaRa EXTaqTM的配方

① 反應(yīng)總體積根據(jù)實(shí)際情況進(jìn)行調(diào)控，可以做 20~50?l 以節(jié)約試劑；

② 將上表各成分加入到 0.2ml 或 0.5ml 滅菌的 PCR 薄壁管中；

③ 如果不用 PCR 儀的加熱蓋，在反應(yīng)混合液的上層加 30 ~50?l 的礦物油防止樣品在 PCR 的過程中蒸發(fā)；

2. 按以下程序進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增。

PCR 反應(yīng)條件視模板、引物等的結(jié)構(gòu)條件不同而各異，在實(shí)際操作中需根據(jù)具體的情況以及 PCR 結(jié)果而進(jìn)行優(yōu)化。

反應(yīng)結(jié)束后，抽取擴(kuò)增樣品 5ul，用瓊脂糖凝膠電泳分析擴(kuò)增結(jié)果，用DNA marker 判斷擴(kuò)增片段的大小或冷凍保存，以備以后分析使用。