凝膠內(nèi)蛋白的顯色

蛋白顯色的階段非常重要，可以知道蛋白遷移的是否均勻、平坦。如果分離后的蛋白需要轉膜，就用銅染，因為考馬斯藍染色是不可逆的。 考馬斯藍染色只用來檢測轉移的有效性，或者蛋白不需要轉膜時，只用于觀測蛋白 SDS-PAGE 分離的結果。

1.a) 考馬斯藍染色

電源關閉，分離的蛋白帶就會擴散，因為蛋白在溶液中是可溶的，為了防止擴散，凝膠中加入 40% 雙蒸水、10% 醋酸、50% 甲醇，能使蛋 白質沉淀（變成不溶性的）。在上述溶液中加入 0.25% 考馬斯亮藍 R-250 使被固定的蛋白染色，在搖床上保持搖動，室溫，4 小時至過夜。 轉移凝膠至 67.5% 雙蒸水、7.5% 醋酸、25% 甲醇混合物中（染料混合物保存起來，可多次重復使用）潤洗，一直在搖床上震搖，中間更換 潤洗液，直到洗去多余染料。染料不會結合到丙烯酰胺上，凝膠背景清晰，凝膠中的蛋白條帶染成深藍色。

2.b) 銅染法

電泳凝膠用蒸餾水清洗數(shù)秒鐘（最多 30 秒），然后轉移至 0.3 M CuCl2 溶液中染色 5-15 分鐘，再用去離子水洗一次，在暗背景下觀察，在 藍色膠背景下蛋白出現(xiàn)透明條帶。

將膠置于 0.1- 0.25 M Tris/0.25 M EDTA pH 8.0 緩沖液中漂洗凝膠完全脫色，根據(jù)廠家說明再置于電轉緩沖液中開始轉膜。

蛋白轉膜

1.詳細的轉膜操作可以在電轉儀廠家的網(wǎng)頁上找到，不同的系統(tǒng)操作也有區(qū)別。蛋白從凝膠至膜的轉移應用的原理是電荷在電場中的遷移。

2.轉膜方式分為半干轉移和濕轉移兩種，半干式轉膜速度快，而濕式轉膜不會因為膜的干燥而失敗，因此成功率高并特別適合用于分子量大 于100kDa 的蛋白。兩種轉膜方式都是膜緊貼凝膠，位于兩層吸收材料之間，固體夾板夾在外面以保證膜和凝膠的緊密接觸。

3.濕式轉膜中膜和凝膠的三明治結構位于濾紙和海綿體之間（海綿/紙/膠/膜/紙/海綿），全部緊密排列，特別是膠/膜之間不能留有氣泡。整 個三明治結構浸泡在轉移緩沖液中，然后施加電場。帶負電荷的蛋白向陽極移動。但膜阻擋了它們，并與其進行結合，從而阻止了它們的 繼續(xù)移動。凝膠一般在 100V 條件下運行 1~2 小時，時間和電壓可以優(yōu)化，我們推薦根據(jù)廠家的說明進行操作。

4.標準的濕轉緩沖液和電泳緩沖液一樣，為不含 SDS 的 1X Tris-gly 緩沖液，加入甲醇至終濃度 20%。如果轉膜的蛋白分子量大于 80kDa， 則推薦加入 SDS 使之終濃度為 0.1%。

5.半干式轉膜中，三明治結構紙/凝膠/膜/紙用轉移緩沖液浸濕，直接置于電轉儀的正負極之間。在進行轉移時，要注意一定要使膜緊貼陽極 而膠緊貼陰極。所用的電轉緩沖液中 Tris 和甘氨酸的比例不一定和濕轉的相同，需參考廠家的儀器說明書。標準配方是：48mM Tris、 39mM 甘氨酸、0.04% SDS、20% 甲醇。

6.兩類膜可供選擇：硝酸纖維素膜和 PVDF 膜（正電荷尼龍膜）。PVDF 膜需要小心地進行前處理：剪出大小合適的膜，在甲醇中浸泡 1-2 分 鐘，再孵育于冰冷的電轉緩沖液中5分鐘。膠也需在冰冷的電轉緩沖液中平衡 3-5 分鐘，否則轉膜時會起皺導致條帶變形。

大蛋白和小蛋白轉膜時的注意事項

電轉移緩沖液中 SDS 與甲醇的平衡、蛋白大小、膠濃度都會影響轉膜效果，如下調(diào)整可以增加轉膜效果。

大蛋白（大于100 kDa）

1.對于大蛋白而言，其在凝膠電泳分離遷移較慢，而從凝膠轉出也非常慢，因此對于這種大分子量蛋白應該用低濃度的凝膠，8%

或更低， 但因低濃度的膠非常易碎，所以操作時需十分小心。

2.大蛋白易在凝膠里形成沉淀，從而影響轉膜。轉膜時在電轉移緩沖液加入 SDS 至終濃度 0.1%，避免出現(xiàn)這種情況。甲醇易使

SDS 從蛋 白上脫失，因此相應降低甲醇的濃度至 10% 或更低，以防止蛋白沉淀。

3.降低電轉移緩沖液中甲醇的比例，這樣可以促進凝膠的膨脹，更易于大蛋白的轉出。

4.只有使用硝酸纖維素膜時，甲醇才是必需的。如果是 PVDF 膜，甲醇可以不必加入電轉移緩沖液中，但轉膜前 PVDF 需用甲醇活化。

5.選擇濕式，4℃ 轉膜過夜，以取代半干式轉膜。

小蛋白（小于100 kDa）

1.SDS 阻止蛋白與膜的結合，小蛋白更是如此。因此，對于小分子的蛋白，電轉移緩沖液中可以不加 SDS。

2.保持 20% 的甲醇濃度對于大于 500kDa 的蛋白，請參考下述文獻：

Bolt and Mahoney, High-efficiency blotting of proteins of diverse sizes following sodium dodecyl sulfate–polyacrylamide,gel electrophoresis. Analytical Biochemistry

247, 185–192 (1997).

更多的轉膜技巧：

避免手指直接接觸膜，應使用鑷子，手指上的油脂與蛋白會封閉轉膜效率并易產(chǎn)生背景污斑。

在濾紙間排列凝膠和膜時，盡量用移液器或 15ml 試管趕除膠與膜之間的氣泡，或在轉移緩沖液中進行以防止氣泡產(chǎn)生，請戴手套！

確認裁剪的膜和濾紙與凝膠尺寸相同，邊緣太大會導致在進行半干式轉膜時電流不能通過膜。

雞抗體易與 PVDF 膜和其它尼龍膜結合，導致高背景，請?zhí)鎿Q成硝酸纖維素膜以降低背景。

膜上蛋白的顯像：麗春紅

為檢測轉膜是否成功，用 TBST 洗膜（TBST 溶液的配制詳見 71 頁緩沖液章節(jié)）。準備貯備液：2% 麗春紅 S 溶于 30% 三氯乙酸和

30% 磺 基水楊酸，室溫下震搖 5 分鐘。1:10 稀釋貯備液。

然后將膜浸泡在水中直至水變清且蛋白條帶清晰。

用 TBST 或水重復洗膜直至膜完全脫色，PVDF 膜需用甲醇活化后再用 TBST 洗。

膜的封閉

有兩種傳統(tǒng)封閉液：脫脂奶粉或 BSA（Cohn 因子 V），脫脂奶粉成本低但不能用于磷酸化蛋白（因脫脂奶粉含有酪蛋白，該蛋白本身就是 一種磷酸化蛋白，會結合磷酸化特異性抗體而易產(chǎn)生高背景。）

為防止一抗或/和二抗與膜的非特異性結合，需要進行膜的封閉。

某些抗體用 BSA 封閉時可能會產(chǎn)生比脫脂奶粉更強的信號，請仔細閱讀說明書，以確定有無特殊封閉膜方法。

用封閉緩沖液封閉 1 小時，4°C 震搖，封閉后用 TBST 洗 5 秒。

一抗的孵育

孵育緩沖液

按抗體說明書建議的稀釋倍數(shù)，用 TBST 稀釋一抗。如果說明書沒有建議稀釋倍數(shù)，則參照一般推薦的稀釋倍數(shù) (1:100-1:3000)進行預試驗，根 據(jù)試驗結果選擇合適稀釋倍數(shù)，一抗?jié)舛冗^高會導致產(chǎn)生非特異性條帶。

某些實驗室傳統(tǒng)上在封閉液中孵育抗體，而有些實驗室用不含封閉劑的 TBST 來孵育抗體，結果因抗體而異，有時兩者結果相同，有時結果 不同。

如果不存在高背景的問題，某些抗體用含低濃度 (0.5 – 0.25%) 脫脂奶粉或 BSA 的封閉液甚至二者都不含的封閉液來稀釋，可產(chǎn)生相對更強的信號條帶。

孵育時間

一抗的孵育時間可從幾小時至過夜（一般不超過 18 小時）不等，具體取決于抗體與蛋白的親和性和蛋白的豐度，建議使用較高的抗體稀釋 倍數(shù)和較長的孵育時間來保證特異性結合。

孵育溫度

如果在封閉液中孵育過夜，應在 4oC 進行，否則污染會導致蛋白降解（特別是磷酸基團）。孵育一抗時需保持適當?shù)膿u動使之均勻覆蓋膜，防 止結合不均勻。

二抗的孵育

一抗孵育結束后，用 TBST 搖動洗膜數(shù)次，每次 5 分鐘或更長，去除殘留的一抗。

孵育緩沖液和稀釋：

按說明書推薦的倍數(shù)用 TBST 稀釋二抗，如果說明書沒有標出稀釋倍數(shù)，則按常規(guī)的倍數(shù)稀釋 (1:1000- 1:20,000) 預實驗，二抗的濃度過高 也會導致非特異性條帶。

可以在封閉液中孵育二抗（和一抗），但可能在降低背景同時導致特異性條帶的信號也減弱，可能是封閉劑阻礙了抗體與靶蛋白的結合。

孵育時間和溫度：

室溫振蕩 1-2 小時。

標記物：推薦使用 HRP 標記二抗，不建議使用 AP（堿性磷酸酶）標記二抗，因其不夠靈敏。

顯色方法

檢測試劑盒：

HRP 標記二抗：傳統(tǒng)上使用 ECL 和 ECL+（自制或購買），推薦使用后者。對于新一代檢測儀器例如 Genegnome，請用儀器制造商推薦的試劑盒。

我們不推薦 ECL 或 BCIP/NBT 試劑盒，因為不夠靈敏。

X-ray 膠片：

傳統(tǒng)上使用手工曝光的方法，可控制 X-ray 膠片在曝光劑和定影劑的時間。而全自動 X-ray 膠片曝光器也已經(jīng)廣泛使用且操作簡便。

過度曝光的膠片不適合用于分析，因為不能判定相對蛋白量。

過度曝光導致全暗的背景沒有反差和/或產(chǎn)生大量的非特異性條帶。

數(shù)字圖像顯影：

新一代的膠片顯色方法是使用數(shù)碼相機在暗室中拍攝膜上的化學發(fā)光，將其轉成數(shù)字信號，再通過儀器自帶的軟件進行分析。

一系列的數(shù)字成像儀都已經(jīng)商品化。新一代數(shù)字成像儀不使用 HRP 標記抗體（即化學發(fā)光），如 STORM 分析儀只檢測熒光標記二抗， Odyssey 紅外線成像系統(tǒng)探測紅外線熒光。