蛋白印跡疑難解答

無信號

一抗和二抗不匹配

二抗需和一抗宿主的物種相同（如一抗來自兔，二抗為抗兔抗體）。

沒有足夠的一抗或二抗結(jié)合目標蛋白

使用高濃度抗體，延長 4℃ 孵育時間（如過夜）。

封閉劑與一抗或二抗有交叉反應(yīng)

使用溫和的去污劑如吐溫-20，或更換封閉劑（常用的脫脂奶粉、BSA、血清或明膠）。

一抗不識別檢測物種的蛋白

參照說明書，比對免疫原序列和蛋白序列以確保抗體和目的蛋白會發(fā)生反應(yīng)，設(shè)置陽性對照。

抗原量不足

每泳道蛋白上樣量不低于 20-30 μg，使用蛋白酶抑制劑并設(shè)置陽性對照。

組織中目的蛋白含量低

濃縮使信號最大化（例如檢測核蛋白要用核裂解物）。

轉(zhuǎn)膜不充分

使用可逆染色劑例如麗春紅 S 檢測轉(zhuǎn)膜效果,檢查轉(zhuǎn)膜操作是否正確。PVDF 膜需預(yù)先浸在甲醇中，然后浸到轉(zhuǎn)移緩沖液中。

洗膜過度

勿過度洗膜。

過度封閉使目標蛋白不能顯色

代替 5% 脫脂奶粉，使用含 0.5% 脫脂奶粉或無脫脂奶粉的抗體稀釋液，或更換封閉劑，減少封閉時間。

一抗失效

使用新鮮抗體，重復(fù)使用有效濃度會降低。

二抗受疊氮鈉抑制

避免疊氮鈉和 HRP 標記抗體一起使用。

檢測試劑盒過期和底物失活

使用新鮮的底物。

背景高

未進行非特異性封閉或封閉不充分

延長封閉時間，考慮更換合適的封閉劑。Abcam 推薦 5% 脫脂奶粉、3% BSA 或血清封閉 30 分鐘。這些可以包含在抗體緩沖液中。

一抗?jié)舛冗^高

稀釋抗體至合適濃度，以更高稀釋度抗體孵育更長時間（耗時長但特異性結(jié)合最好）。

抗體孵育溫度過高

4°C 孵育。

二抗與封閉劑非特異性結(jié)合或反應(yīng)

設(shè)置二抗對照(不加一抗)。

一抗或二抗與封閉劑有交叉反應(yīng)

在孵育和洗滌液中加入溫和去污劑如吐溫 -20。脫脂奶粉含有酪蛋白，該蛋白本身就是一種磷酸化蛋白，會結(jié)合磷酸化特異性抗

體而易產(chǎn)生 高背景。使用 BSA 代替奶粉作為封閉劑。

未結(jié)合蛋白質(zhì)洗滌不充分

增加洗滌次數(shù)。

膜的選擇導(dǎo)致的高背景

NC 膜比 PVDF 膜背景低。

膜干燥

在孵育過程中防止膜變干，在任何步驟都保證膜有充分的反應(yīng)液，放入攪拌子不斷攪動或輕輕振蕩使膜浸在溶液中，避免出現(xiàn)干

膜現(xiàn)象。

多帶現(xiàn)象

細胞傳代次數(shù)過多，使其蛋白表達不同

使用原始未傳代的細胞株，和現(xiàn)在的細胞株一起做平行對照實驗。

體內(nèi)表達的蛋白樣本具有多種修飾形式如乙酰化、甲基化、烷基化、磷酸化、糖基化等

查閱文獻，使用試劑使樣品去磷酸化、去糖基化來驗證翻譯后的修飾。

蛋白樣本降解（蛋白質(zhì)分子量降低）

在樣品緩沖液中加入足夠的蛋白酶抑制劑。

檢測到未經(jīng)報道過的新蛋白或同一蛋白家族中具有相似表位而結(jié)構(gòu)不同的蛋白

查閱其它文獻報道，或 BLAST 搜尋，使用說明書推薦的細胞株或組織。

一抗?jié)舛冗^高，高濃度時常出現(xiàn)多條蛋白帶

降低抗體濃度和/或孵育時間。

二抗?jié)舛冗^高，高濃度產(chǎn)生非特異性結(jié)合

降低抗體濃度，增加二抗對照（不加一抗）。

抗體未經(jīng)純化

使用親和純化的抗體，減少非特異條帶。

條帶為非特異性條帶

應(yīng)用封閉多肽來區(qū)分特異性和非特異性條帶，只有特異性條帶能被封閉從而消失。

靶蛋白形成多聚體

SDS-PAGE 電泳上樣前，煮沸 10 分鐘而不是 5 分鐘，使蛋白質(zhì)解聚。

背景有不均勻的白色斑點

轉(zhuǎn)膜時膜上有氣泡或抗體在膜上分布不均

轉(zhuǎn)膜過程中盡量去除氣泡，抗體孵育時保持搖動。

背景有黑色斑點

抗體結(jié)合了封閉劑

過濾封閉劑。

深背景出現(xiàn)白色條帶（非預(yù)期背景）

一抗或二抗加入過多

稀釋抗體的濃度。

分子量蛋白標準條帶呈黑色

抗體和分子量蛋白標準發(fā)生了反應(yīng)

在分子量蛋白標準和第一個樣品之間增加一個空白條帶。

目的條帶染色過低/過高

分離不徹底

改變凝膠比例：分子量大的蛋白用低濃度膠，分子量小的蛋白用高濃度膠。

“微笑”條帶

遷移過快

電泳溫度過高（改變了 pH 值和遷移速度）

降低遷移速度或低溫電泳(冷庫或冰上)。

相同的蛋白雜交出現(xiàn)大小不均勻條帶

制備凝膠時凝膠凝固太快，致使泳道中丙烯酰胺的比例不均勻

參照凝膠的配方，在凝膠中加入適量 TEMED，放置時在凝膠頂部加入適量 0.1% SDS（水稀釋）以防凝膠變干。

凝膠染色不均勻

細菌污染

4°C 保存抗體并使用新鮮的緩沖液浸泡凝膠。

抗體量不足

確保在振蕩孵育時抗體充分浸沒膜。