電泳可以是單相的（即一維分離）也可以是雙相的。單相電泳常用來(lái)進(jìn)行蛋白和核酸的分離，蛋白的雙相電泳用于指紋-識(shí)別（即總蛋白成分分析）和細(xì)胞里所有蛋白的精確定位。

這里我們所描述的是單相電泳技術(shù)。我們推薦《Gel Electrophoresis of Proteins: A Practical Approach》（第三版，B. D.Hames 和 D. Rickwood 主編，實(shí)用方法系列，牛津大學(xué)出版社，1998年）這本書作為理解雙相電泳的參考。

PAGE 凝膠的制備

聚丙烯酰胺凝膠電泳，英文簡(jiǎn)稱是 SDS-PAGE (Sodium Dodecyl Sulfate PolyAcrylamide Gel Electrophoresis)，是根據(jù)蛋白質(zhì)分子量來(lái)分離 蛋白質(zhì)的基本方法。

聚丙烯酰胺凝膠由兩種復(fù)合物混合而成，丙烯酰胺和 N,N-亞甲基丙烯酰胺（簡(jiǎn)稱bis）。Bis 是凝膠的交聯(lián)劑。通過(guò)加入過(guò)硫酸銨和 DMAP 或 TEMED 啟動(dòng)交聯(lián)聚合作用。凝膠是中性，水溶性三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)（通過(guò)亞甲基交聯(lián)的碳?xì)浠衔铮?/p>

凝膠對(duì)分子的分離取決于凝膠所形成的孔徑大小。凝膠孔徑的大小由兩個(gè)因素決定：丙烯酰胺的總量（%T）和交聯(lián)的數(shù)量（%C），當(dāng)丙烯 酰胺的比例升高，孔徑降低。5% C 時(shí)孔徑最小。C% 增加或減少，孔徑也隨之增大或減少。凝膠以百分比進(jìn)行設(shè)計(jì)，并且有二個(gè)重要的參 數(shù)。總丙烯酰胺指的是丙烯酰胺加上bis丙烯酰胺所占的百分比(w/v)。例如，7.5% T 表示 100ml 凝膠中有 7.5 g丙烯酰胺和 bis。

凝膠可以商業(yè)購(gòu)買或在實(shí)驗(yàn)室自己制備。膠凝體的百分比對(duì)蛋白質(zhì)遷移率和分離度至關(guān)重要。

拇指原則：目標(biāo)蛋白分子量越小，mono/bis百分比越高；目標(biāo)蛋白分子量越大，mono/bis的百分比越低。

丙烯酰胺是潛在的有累積作用的神經(jīng)毒素：操作時(shí)要一直佩戴手套。

按照廠家說(shuō)明將凝膠放在電泳槽中并且浸泡在電泳緩沖液中。

陽(yáng)性對(duì)照

陽(yáng)性對(duì)照裂解物用來(lái)表明試驗(yàn)是有效的并且是正確的，及可證明目標(biāo)蛋白不在樣本中表達(dá)。

當(dāng)設(shè)定一個(gè)新實(shí)驗(yàn)時(shí)，我們強(qiáng)烈推薦使用陽(yáng)性對(duì)照裂解物，這將提高試驗(yàn)的可信度。

分子量標(biāo)準(zhǔn)

跑在樣品旁邊的分子量標(biāo)準(zhǔn)能測(cè)定蛋白分子量的大小并且能監(jiān)測(cè)電泳的進(jìn)展。市面上有許多分子量標(biāo)準(zhǔn)可供選擇。

分子量標(biāo)準(zhǔn)：

貨號(hào) ab48854 (MW 70, 57, 40, 28, 18, 13.5 and 8.5 kDa)

貨號(hào) ab115832, Prism Protein Ladder (10-175 kDa)

貨號(hào) ab116027, Prism Ultra Protein Ladder (10-180 kDa)

貨號(hào) ab116028, Prism Ultra Protein Ladder (10-245 kDa)

貨號(hào) ab116029, Prism Ultra Protein Ladder (3.5-245 kDa)

上樣和跑凝膠

使用特定的凝膠上樣吸頭或微型注射器在狹窄的樣品池中加入全部樣品，注意不要用尖頭刺破池的底部，否則會(huì)形成扭曲的條帶。

不要過(guò)度填充樣品池，如果樣品溢入旁邊的樣品池，將會(huì)影響結(jié)果。 每個(gè)樣品池裝載 20-40μg 蛋白。

將凝膠浸泡在電泳緩沖液中，這些緩沖液通常包含 SDS，天然的凝膠電泳除外。

一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)的 PAGE 電泳緩沖液，又叫運(yùn)行（running）緩沖液，是1×氨基乙酸-甘氨酸（參見(jiàn)第 71 頁(yè)的緩沖液章節(jié)）。

跑凝膠時(shí)按照廠家推薦的時(shí)間進(jìn)行，這些可以隨著儀器的改變而變更（根據(jù)電壓，1 小時(shí)至過(guò)夜）。

當(dāng)染料分子（“遷移前沿”）到達(dá)凝膠的底部，關(guān)閉電源。此時(shí)蛋白會(huì)從凝膠上慢慢的洗脫，因此不要保存在凝膠里，要迅速進(jìn)行下一步的 轉(zhuǎn)移操作。

內(nèi)參的使用

內(nèi)參是用來(lái)檢測(cè)凝膠中的泳道是否載有相同的上樣量。在比較不同樣品的蛋白表達(dá)水平時(shí)這一點(diǎn)尤其重要。這對(duì)檢查整個(gè)凝膠的平均轉(zhuǎn)膜亦 十分重要。如有上樣或轉(zhuǎn)膜不平均的情況，內(nèi)參對(duì)照可用來(lái)定量每條泳道的蛋白量。對(duì)于準(zhǔn)備發(fā)表出版的試驗(yàn)，加入對(duì)照是絕對(duì)必需的。