蛋白質(zhì)印跡實(shí)驗(yàn)中當(dāng)轉(zhuǎn)印膜被浸濕，蛋白質(zhì)結(jié)合可通過(guò)蛋白質(zhì)與膜的接觸而實(shí)現(xiàn)。由于蛋白與膜結(jié)合的發(fā)生貫穿整個(gè)膜的厚度（深度），結(jié)合能力是由孔的內(nèi)部表面積來(lái)決定的。P轉(zhuǎn)印膜與PSQ轉(zhuǎn)印膜在蛋白結(jié)合能力上有何差異？影響蛋白質(zhì)結(jié)合的因素有哪些？請(qǐng)看本文。

PVDF本質(zhì)是一種疏水性的聚合物，在水溶液中不會(huì)浸濕。為了在水性緩沖液和系統(tǒng)中使用PVDF膜，首先必須將其浸泡在50%（v/v）或更高濃度的醇溶液中。甲醇、乙醇和異丙醇都適合浸泡這種膜。隨著膜的外觀從不透明到半透明，完全浸濕是顯而易見(jiàn)的。之后必須用水反復(fù)沖洗，以去除醇類，再將膜直接放入轉(zhuǎn)印緩沖液中平衡。

P轉(zhuǎn)印膜 VS PSQ轉(zhuǎn)印膜

一旦膜被浸濕，蛋白質(zhì)結(jié)合可通過(guò)蛋白質(zhì)與膜的接觸而實(shí)現(xiàn)。由于蛋白與膜結(jié)合的發(fā)生貫穿整個(gè)膜的厚度（深度），結(jié)合能力是由孔的內(nèi)部表面積來(lái)決定的（Mansfield，1994）。PSQ轉(zhuǎn)印膜的內(nèi)部表面積大約是P轉(zhuǎn)印膜的三倍，使其吸附能力更高（表2）。表2中所列的數(shù)值代表了膜表面在非變性緩沖液中飽和后蛋白質(zhì)結(jié)合的上限。在任一指定的應(yīng)用中，都可以預(yù)期PSQ轉(zhuǎn)印膜能比P轉(zhuǎn)印膜結(jié)合更多的蛋白質(zhì)。

然而，分析中可實(shí)現(xiàn)的最大結(jié)合能力往往取決于所采用的具體操作步驟，這是由于蛋白質(zhì)構(gòu)象的差異，所使用緩沖液的化學(xué)性質(zhì)，以及樣品上樣所用方法的限制。

P轉(zhuǎn)印膜與PSQ轉(zhuǎn)印膜之間結(jié)合差異的例子如圖1所示，其中蛋白質(zhì)樣品從聚丙烯酰胺凝膠上電轉(zhuǎn)過(guò)來(lái)。部分蛋白質(zhì)穿過(guò)P轉(zhuǎn)印膜，被第一張膜后面的第二張膜所捕獲。相比之下，所有蛋白質(zhì)與PSQ轉(zhuǎn)印膜結(jié)合，而未穿過(guò)。在這種情況下，緊密的孔結(jié)構(gòu)和聚合物較高的內(nèi)部表面積有助于所有轉(zhuǎn)移蛋白的完全吸附。不過(guò)，PSQ轉(zhuǎn)印膜上的免疫檢測(cè)可能產(chǎn)生較高的背景，需要更嚴(yán)格的清洗條件。因此，膜的選擇是由實(shí)驗(yàn)?zāi)繕?biāo)決定的：對(duì)于>20 kDa蛋白質(zhì)的高靈敏度檢測(cè)，使用P轉(zhuǎn)印膜，但如果分析較小的蛋白質(zhì)，或必須捕獲100%的蛋白質(zhì)進(jìn)行肽段測(cè)序，則要轉(zhuǎn)換成PSQ轉(zhuǎn)印膜。

圖1. 利用P轉(zhuǎn)印膜和PSQ轉(zhuǎn)印膜進(jìn)行蛋白質(zhì)的延長(zhǎng)電轉(zhuǎn)。分子量標(biāo)準(zhǔn)品（第1、3、5、7泳道）和小牛肝裂解液（第2、4、6、8泳道）通過(guò)槽轉(zhuǎn)印法轉(zhuǎn)移到P轉(zhuǎn)印膜或PSQ膜，并用考馬斯亮藍(lán)染色。在第一張PSQ轉(zhuǎn)印膜的后面再放一張，以捕獲穿過(guò)的蛋白質(zhì)。（第5和6泳道在P后面；第7和8泳道在PSQ后面。）

影響蛋白質(zhì)結(jié)合的因素

在分子水平，蛋白質(zhì)吸附至少部分源于疏水氨基酸側(cè)鏈與聚合物表面疏水區(qū)的相互作用。Matsudaira（1987）觀察到，在疏水殘基被切割之后，小肽的測(cè)序效率下降80%，這可能是由于殘余肽段被洗脫。同時(shí)，在肽段消化降解時(shí)，人們也觀察到疏水肽段往往不能像親水肽段那樣高效洗脫（如Iwamatsu，1991；Fernandez等，1992）。McKeon和Lyman（1991）表明，轉(zhuǎn)印緩沖液中添加的Ca2+離子可增強(qiáng)鈣調(diào)蛋白與Immobilon?-P轉(zhuǎn)印膜的結(jié)合。鈣的結(jié)合導(dǎo)致蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)中形成一個(gè)疏水袋。