【前情回顧】Epigentek : 染色質(zhì)研究

【前情回顧】Epigentek染色質(zhì)可及性分析試劑盒，解碼基因組的創(chuàng)新工具

表觀遺傳修飾在基因調(diào)控中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，對多種生物過程有著深遠的影響。染色質(zhì)免疫沉淀（ChIP）一直是研究細胞中表觀遺傳修飾和蛋白質(zhì)-DNA相互作用的金標準。然而，傳統(tǒng)的ChIP存在一些局限性，包括需要大量的起始材料、處理時間長以及分辨率較低。兩種新興技術(shù)——靶向切割與核酸酶釋放（CUT&RUN）和靶向切割與標記（CUT&Tag）——作為ChIP的有力替代方法脫穎而出。更重要的是，最近，表觀遺傳研究專家EpigenTek公司進一步改進了CUT&RUN-Fast方法，推出了新的CUT&LUNCH（Cleavage Under Target and Liberate Unique Nucleic Complex Homogeneously，靶向切割與均勻釋放獨特核酸復(fù)合物）技術(shù)，該技術(shù)具有極其快速的實驗流程、進一步提升的特異性以及最小化的背景信號。本文將比較傳統(tǒng)的ChIP與CUT&RUN和CUT&Tag，以及新興的CUT&LUNCH技術(shù)，并討論它們的優(yōu)缺點。

在染色質(zhì)免疫沉淀（ChIP）過程中，首先將蛋白質(zhì)與DNA進行交聯(lián)。隨后，固定后的染色質(zhì)被片段化，接著利用抗體特異性地免疫沉淀目標蛋白質(zhì)（例如，轉(zhuǎn)錄因子、組蛋白修飾、染色質(zhì)重塑因子）及其相關(guān)聯(lián)的DNA片段。最后，通過純化和測序這些DNA片段，可以確定目標蛋白質(zhì)結(jié)合的基因組區(qū)域。盡管染色質(zhì)免疫沉淀（ChIP）是研究蛋白質(zhì)-DNA相互作用的有力工具，但它也存在一些缺點：

(1) 大多數(shù)ChIP實驗需要大量的起始材料，這在處理有限的細胞數(shù)量或稀有細胞群體時可能是一個挑戰(zhàn)。

(2) 該技術(shù)過程繁瑣，涉及多個步驟，包括交聯(lián)、片段化和免疫沉淀，整個過程可能需要數(shù)天才能完成。

(3) ChIP的分辨率有限，因為免疫沉淀的DNA片段可能包含未被目標蛋白質(zhì)結(jié)合的區(qū)域。

CUT&RUN和CUT&Tag技術(shù)的開發(fā)旨在解決這些不足。這兩種技術(shù)均在完整細胞或細胞核中進行，無需固定處理，通過核酸酶在特異性抗體結(jié)合位點切割染色質(zhì)，并直接捕獲蛋白質(zhì)-DNA復(fù)合物。CUT&RUN操作流程包括抗體介導(dǎo)的核膜通透化，隨后由融合蛋白在抗體結(jié)合的目標蛋白區(qū)域進行DNA切割。融合蛋白由切割域（如微囊藻核酸酶或MNase）和結(jié)合抗體的蛋白A/G（pAG）域組成。抗體特異性結(jié)合目標蛋白，pAG-MNase融合蛋白與抗體結(jié)合，并在蛋白質(zhì)-DNA相互作用位點切割染色質(zhì)，從而釋放蛋白質(zhì)-DNA復(fù)合物。CUT&Tag與CUT&RUN類似，但在切割過程中加入了轉(zhuǎn)座酶，該酶將測序接頭插入切割后的DNA片段中。隨后對DNA進行擴增和測序。CUT&RUN和CUT&Tag是有效的技術(shù)，有望克服ChIP的一些局限性：1.它們所需的起始材料更少。CUT&RUN可以在低至1000個細胞的情況下進行，而CUT&Tag甚至可以在少于100個細胞的情況下進行;2.處理時間更短，CUT&RUN的完成時間不到半天，CUT&Tag的完成時間不到一天;3.CUT&RUN和CUT&Tag的分辨率高于ChIP，因為它們在細胞內(nèi)原位切割染色質(zhì)，從而可以直接捕獲蛋白質(zhì)-DNA復(fù)合物;4. CUT&Tag是一種單管反應(yīng)，簡化了操作流程，并減少了所需的起始材料;5. 這兩種技術(shù)的背景噪聲均低于ChIP，從而實現(xiàn)了更高的信噪比。

隨著CUT&RUN和CUT&Tag的不斷優(yōu)化和完善，它們有可能在表觀遺傳學(xué)領(lǐng)域得到更廣泛的應(yīng)用。特別是，CUT&RUN和CUT&Tag的高分辨率和低背景噪聲使它們成為研究稀有細胞群或低豐度蛋白質(zhì)的有吸引力的選擇。此外，CUT&Tag的單管反應(yīng)可能對高通量應(yīng)用特別有用，例如單細胞測序。CUT&RUN- fast是改進的CUT&RUN技術(shù)，CUT&RUN- fast技術(shù)采用了一種新穎獨特的核酸切割酶混合物，具有低序列偏倚，可以同時切割染色質(zhì)并切割/去除靶蛋白/DNA復(fù)合物兩端的任何DNA序列，而不會影響靶蛋白所占據(jù)的DNA，從而提高了特異性和分辨率。

近來，EpigenTek進一步完善了CUT&RUN-Fast方法，采用新的靶下切割和均勻釋放獨特的核酸復(fù)合物（CUT&LUNCH），該方法具有極快的操作流程，進一步增強了特異性，并最小化了背景。