近年來，關(guān)于T細(xì)胞對嚴(yán)重急性呼吸系統(tǒng)綜合征冠狀病毒2型（SARS-CoV-2）的免疫反應(yīng)研究逐漸深入。有研究表明，在未接觸過SARS-CoV-2的個(gè)體中存在針對該病毒的T細(xì)胞免疫反應(yīng)，這可能是由于普通感冒冠狀病毒（CCCs）特異性T細(xì)胞的交叉識別所致。然而，真正的T細(xì)胞交叉反應(yīng)性，即單個(gè)T細(xì)胞受體（TCR）識別多種不同的肽-MHC配體的能力，在SARS-CoV-2的背景下尚未被證實(shí)。

“Functional characterization of CD4+ T cell receptors crossreactive for SARS-CoV-2 and endemic coronaviruses”旨在利用病毒特異性T細(xì)胞功能擴(kuò)增平臺(tái)（ViraFEST），在康復(fù)期COVID-19患者（CCPs）和未接觸過SARS-CoV-2的捐贈(zèng)者中，識別針對SARS-CoV-2和CCCs刺突蛋白（S蛋白）的交叉反應(yīng)性T細(xì)胞受體（TCR）克隆型。通過確認(rèn)SARS-CoV-2/CCC交叉反應(yīng)性并評估其功能親和力，以期深入理解交叉反應(yīng)性T細(xì)胞在COVID-19患者中的免疫機(jī)制和臨床影響。

實(shí)驗(yàn)方法

1. 樣本收集與處理：

CCPs樣本：來自COVID-19康復(fù)患者，通過鼻拭子PCR測試確認(rèn)SARS-CoV-2感染，癥狀輕微且未住院。

未暴露捐贈(zèng)者（PCs）樣本：在SARS-CoV-2流行前（2017年至2019年）收集。

使用Ficoll-Paque PLUS梯度離心法從白細(xì)胞分離產(chǎn)品或全血中分離外周血單核細(xì)胞（PBMCs），并保存在-140°C。

2. ViraFEST平臺(tái)應(yīng)用：

利用ViraFEST平臺(tái)檢測CCPs和PCs外周血中的特異性T細(xì)胞反應(yīng)。該平臺(tái)通過10天的T細(xì)胞培養(yǎng)，結(jié)合相關(guān)抗原進(jìn)行特異性抗原記憶T細(xì)胞反應(yīng)和TCR的識別。

使用覆蓋SARS-CoV-2 S蛋白和四種已知CCC（HCoV-NL63, HCoV-OC43, HCoV-229E, HCoV-HKU1）S蛋白的重疊肽池刺激CD4+ T細(xì)胞。

3.TCR克隆與轉(zhuǎn)染：

通過單細(xì)胞TCR測序識別TCR的α鏈和β鏈序列。

將完整的TCR基因塊克隆到CD4過表達(dá)的Jurkat NFAT-熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)中，該系統(tǒng)通過NFAT激活定量讀取TCR參與的強(qiáng)度，即功能親和力。

4.肽刺激與細(xì)胞因子染色：

使用JPT提供的SARS-CoV-2 S、HCoV-NL63 S，陽性對照（貨號PM-CEFX-3）或無肽刺激的CCPs和PCs的PBMCs進(jìn)行體外培養(yǎng)。

培養(yǎng)后，通過細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子染色檢測IL-2和IFN-γ的產(chǎn)生。

5. 數(shù)據(jù)分析與統(tǒng)計(jì)：

使用嚴(yán)格的算法識別抗原特異性TCR克隆型。

通過比較SARS-CoV-2 S和CCC S肽刺激下的TCR擴(kuò)展頻率，評估交叉反應(yīng)性TCR的功能親和力。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果

1. 交叉反應(yīng)性T細(xì)胞的存在：

在65%的CCPs和未暴露捐贈(zèng)者中檢測到能夠交叉識別SARS-CoV-2和至少一種其他CCC S蛋白的記憶CD4+ T細(xì)胞克隆型。

多個(gè)捐贈(zèng)者之間共享了這些TCRs，表明存在公共TCR克隆型。

2. 功能親和力分析：

交叉反應(yīng)性T細(xì)胞在體外相對于單特異性CD4+ T細(xì)胞顯示出顯著受損的SARS-CoV-2特異性增殖能力，這與它們對SARS-CoV-2的較低功能親和力一致。

使用Jurkat報(bào)告細(xì)胞系確認(rèn)了交叉反應(yīng)性TCR對SARS-CoV-2和HCoV-NL63 S肽的功能親和力，發(fā)現(xiàn)SARS-CoV-2特異性TCR的功能親和力顯著低于HCoV-NL63特異性TCR。

3. 抗原表位鑒定：

通過肽滴定實(shí)驗(yàn)鑒定了交叉反應(yīng)性TCR識別的具體表位，發(fā)現(xiàn)這些表位位于SARS-CoV-2和HCoV-NL63 S蛋白的保守區(qū)域。

某些交叉反應(yīng)性TCR識別相同的保守免疫優(yōu)勢表位，表明這些表位可能是設(shè)計(jì)通用冠狀病毒疫苗的潛在靶點(diǎn)。

4. 未暴露捐贈(zèng)者中的交叉反應(yīng)性T細(xì)胞：

在未暴露于SARS-CoV-2的捐贈(zèng)者中也檢測到了交叉反應(yīng)性記憶CD4+ T細(xì)胞，表明這些克隆型在COVID-19大流行前已存在。

這些交叉反應(yīng)性T細(xì)胞在體外抗原刺激下能夠功能擴(kuò)展，表明它們具有抗原特異性擴(kuò)展能力。

本研究首次在SARS-CoV-2背景下證實(shí)了真正的T細(xì)胞交叉反應(yīng)性，即單個(gè)TCR克隆型能夠識別SARS-CoV-2和CCC S蛋白。交叉反應(yīng)性T細(xì)胞在未暴露捐贈(zèng)者和COVID-19康復(fù)患者中均存在，但它們對SARS-CoV-2的功能親和力較低，這可能是由于抗原印記現(xiàn)象導(dǎo)致的。這些發(fā)現(xiàn)不僅加深了我們對T細(xì)胞介導(dǎo)的SARS-CoV-2免疫反應(yīng)的理解，還為未來冠狀病毒疫苗的設(shè)計(jì)提供了重要參考，提示通過針對保守表位的疫苗設(shè)計(jì)可能誘導(dǎo)更廣泛的交叉保護(hù)性免疫反應(yīng)。本研究中JPT提供的覆蓋SARS-CoV-2 S蛋白和四種CCC S蛋白的重疊肽池，作為特異性抗原刺激CD4+ T細(xì)胞，使得研究人員能夠準(zhǔn)確識別和擴(kuò)增出針對這些病毒的特異性T細(xì)胞。

JPT作為多肽生產(chǎn)專家，可以提供各種不同形式的SARS-CoV-2肽池：