氨甲酰化是一種非酶促且不可逆的蛋白質(zhì)翻譯后修飾，其中氰酸/異氰酸向賴氨酸側(cè)鏈的ε-氨基添加一個羰基團，將賴氨酸轉(zhuǎn)化為非標準氨基酸同型瓜氨酸。氰酸主要由尿素分解形成，也可以在髓過氧化物酶的作用下，通過硫氰酸鹽的氧化在炎癥部位形成，例如動脈粥樣硬化組織。低密度脂蛋白(LDL)可以發(fā)生羰基化，具有動脈粥樣硬化性質(zhì)，破壞LDL受體結(jié)合，增加血管平滑肌細胞增殖和內(nèi)皮細胞死亡。患有導致尿素水平升高的疾病（如慢性和終末期腎臟疾病）的患者血漿中的蛋白質(zhì)羰基化和羰基化LDL水平增加。此外，血漿中與蛋白質(zhì)結(jié)合的同型瓜氨酸水平與主要不良心臟事件的頻率和死亡率呈正相關，并可預測心血管疾病風險。羰基化蛋白還可以誘導免疫反應，導致抗同型瓜氨酸自身抗體的產(chǎn)生，這些抗體在類風濕關節(jié)炎患者中水平較高，并與關節(jié)損傷程度呈正相關。

艾美捷氨基甲酸酯化IP試劑盒（#601930-1）提供了一種方便的方法，用于從細胞裂解液中捕獲和濃縮羰基化蛋白，該方法是使用與瓊脂糖珠偶聯(lián)的抗羰基化單克隆抗體。從樹脂中洗脫捕獲的蛋白后，可以通過SDS-PAGE進行分離，并通過西方印跡(WB)分析，使用試劑盒中包含的抗羰基化(同型瓜氨酸)多克隆抗體或用戶提供的特定目標抗體。試劑盒中提供的陽性對照樣本確保了檢測的適當性能:

1. 確定處理樣本與未處理樣本中賴氨酸羰基化的變化。

2. 證明目標蛋白在體外發(fā)生了羰基化。

3. 通過西方印跡和蛋白質(zhì)組學分析鑒定和表征羰基化蛋白。

檢測前準備

試劑準備:

除非另有說明，所有試劑都可以直接使用。裂解緩沖液

·檢測與廣泛的裂解緩沖液兼容

·避免使用會導致蛋白質(zhì)變性的緩沖液成分

·盡可能減少還原劑（例如，DTT）和洗滌劑的使用

·建議的裂解緩沖液：50 mM Tris-HCl，pH 7.5，含有150 mM NaCl，0.5%（體積/體積）NP-40，以及蛋白酶抑制劑混合物。

洗脫試劑:

選擇適合預期分析方法的適當洗脫試劑：

a) SDS-PAGE樣品加載緩沖液，用于WB分析

b) 0.1%甲酸，用于蛋白質(zhì)組學分析

樣品準備:

推薦的樣品/對照裂解液的體積和濃度為200μl，濃度為1-5 mg/ml，作為一個起點。如有必要，用裂解緩沖液調(diào)整裂解液濃度。建議使用500 ng羰基化牛血清白蛋白作為陽性對照。

執(zhí)行檢測

檢測優(yōu)化:

從特定裂解液樣本中捕獲羰基化蛋白的最佳檢測條件必須由用戶確定。調(diào)整以下參數(shù)可能有助于此過程：

- 樣本體積：100-500μl

- 樣本濃度：1-5mg/ml

- 羰基化親和吸附劑體積：40μl懸浮液（20μl沉降樹脂）

- 檢測時間：最少1小時至過夜

在整個設置過程中，保持反應組分在冰上。

羰基化親和吸附劑準備:

1. 通過輕輕倒置管子，重新懸浮羰基化親和吸附劑（項目編號601931）。

2. 將40μl的羰基化親和吸附劑懸浮液（20μl沉降樹脂）分裝到所需數(shù)量的微量離心管中。

3. 每個管子加入1ml洗滌緩沖液。

a. 使用移液器混合。

b. 以低速（500-1,000xg，兩分鐘）離心以收集基質(zhì)。

c. 丟棄流穿液。

4. 至少重復基質(zhì)洗滌/收集步驟兩次。

5. 向管中加入200μl樣本裂解液或500 ng羰基化牛血清白蛋白對照。

6. 在4℃下旋轉(zhuǎn)混合孵育1小時。

7. 以低速（500-1,000×g，兩分鐘）離心以收集基質(zhì)。

8. 移除流穿液并保留為“未結(jié)合部分”，以備后續(xù)分析（如需要）。

9. 將柱子放回收集管中。

10. 通過向管中加入1ml洗滌緩沖液來洗滌基質(zhì)。

· 以低速（500-1,000×g，兩分鐘）離心以收集基質(zhì)。

· 再重復洗滌步驟三次。

11. 對于SDS-PAGE/WB分析：

· 在最后一次洗滌后盡可能移除流穿液，但不要移除樹脂。

· 向管中加入20μl的1X SDS-PAGE樣品緩沖液并用手指輕彈混合。

· 加熱至75℃，持續(xù)10分鐘。

· 以低速（500-1,000×g，兩分鐘）離心以收集洗脫物。

12. 對于蛋白質(zhì)組學分析：

· 在最后一次洗滌后盡可能移除流穿液，但不要移除樹脂。

· 向樹脂中加入10倍體積（200μl）的0.1%甲酸。

· 在室溫下旋轉(zhuǎn)混合5-10分鐘。

· 以低速（500-1,000xg，兩分鐘）離心以收集洗脫物。

· 將洗脫液冷凍干燥并在后續(xù)處理分析前重新懸浮于胰蛋白酶消化或其他緩沖液中，或存儲于-20℃。

化驗結(jié)果示例:

圖.氨甲酰化IP試劑盒的蛋白質(zhì)印跡分析。使用甲酰化親和吸附劑將甲酰化和對照細胞裂解物以及提供的陽性對照物拉下，洗脫，在12%凝膠上運行，轉(zhuǎn)移硝化纖維素，并用提供的抗甲酰化（高瓜氨酸）多克隆抗體進行檢測。這些數(shù)據(jù)表明，親和吸附蛋白和多克隆抗體都只識別氨基甲酰化蛋白。