ALPCO胰島素ELISA用于定量測(cè)定血清和血漿中的胰島素。

艾美捷胰島素ELISA（ALP-80-INSHU-E01.1）檢測(cè)原理：

ALPCO胰島素ELISA是一種夾心型免疫測(cè)定法。96孔微孔板涂有胰島素特異性單克隆抗體。將標(biāo)準(zhǔn)品、對(duì)照品和樣品加入帶有檢測(cè)抗體的微孔板孔中。然后將微孔板在酰胺板振蕩器上以700-900rpm的速度孵育。第一次孵育完成后，用洗滌緩沖液洗滌孔并吸干。加入TMB底物，在微孔板振蕩器上以700-900rpm的速度第二次孵育微孔板。一旦第二次孵育完成，加入停止溶液，用分光光度計(jì)在450nm處測(cè)量光密度（OD）。產(chǎn)生的顏色強(qiáng)度與樣品中胰島素的量成正比。

胰島素ELISA測(cè)定程序：

所有試劑和微孔板條在使用前應(yīng)平衡至室溫（18-25°C）。使用前輕輕混合所有試劑。每次測(cè)定運(yùn)行和每次使用多個(gè)微孔板時(shí)，都必須執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)曲線。所有標(biāo)準(zhǔn)品、對(duì)照品和樣本都應(yīng)雙重運(yùn)行。

1. 在打開(kāi)鋁箔袋前，應(yīng)先將微孔板平衡至室溫。為標(biāo)準(zhǔn)品、對(duì)照品和樣本的雙重測(cè)定分配足夠的微孔板條。其余的微孔板條應(yīng)存放在含干燥劑的密封鋁箔袋中，置于2-8°C。

2. 將每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品、對(duì)照品和樣本的25微升分別吸入相應(yīng)的孔中。見(jiàn)試劑準(zhǔn)備部分以獲取對(duì)照品重組說(shuō)明。

3. 向每個(gè)孔中加入100微升的檢測(cè)抗體。

4. 用板封膜覆蓋微孔板，在室溫下孵育1小時(shí)，在微孔板振蕩器上以700-900轉(zhuǎn)每分鐘的速度搖動(dòng)。

5. 倒掉孔中的內(nèi)容物，使用微孔板洗滌器用每次350微升的工作強(qiáng)度洗滌緩沖液洗板6次（見(jiàn)試劑準(zhǔn)備）。或者，使用洗滌瓶（不要使用多通道移液管）將工作強(qiáng)度洗滌緩沖液注入孔中。每次洗滌之間，將微孔板倒置以丟棄液體，并在吸水紙上用力拍打倒置的微孔板。在最后洗滌后（自動(dòng)或手動(dòng)），通過(guò)倒置并用力拍打微孔板在吸水紙上，去除孔中的任何殘留洗滌緩沖液和氣泡。

6. 向每個(gè)孔中加入100微升的TMB底物。

7. 用板封膜覆蓋微孔板，在室溫下孵育15分鐘，在微孔板振蕩器上以700-900轉(zhuǎn)每分鐘的速度搖動(dòng)。

8. 向每個(gè)孔中加入100微升的終止溶液，并輕輕搖動(dòng)微孔板以混合內(nèi)容物。在進(jìn)行下一步之前，去除任何氣泡。

9. 將微孔板放入能夠讀取450納米吸光度的微孔板閱讀器中。在加入終止溶液后應(yīng)立即分析微孔板，且不得超過(guò)30分鐘。

胰島素ELISA結(jié)果計(jì)算：

從標(biāo)準(zhǔn)品中構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線。零標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)作為空白，其平均值從每個(gè)孔中減去。建議使用軟件程序來(lái)計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)曲線并確定樣本的濃度。胰島素ELISA是一種配體結(jié)合測(cè)定，其響應(yīng)與分析物濃度呈現(xiàn)S形關(guān)系。目前被普遍接受的此類曲線的參考模型使用4或5參數(shù)邏輯（pl）擬合，因?yàn)檫@些模型可以在更大的范圍內(nèi)優(yōu)化準(zhǔn)確性和精確度。盡管三次樣條和其他模型是可以接受的方法，但它們通常在范圍的低端和高端顯示出較低的測(cè)定內(nèi)準(zhǔn)確性和精確度。在以下示例中，使用了5參數(shù)邏輯擬合來(lái)最大化低濃度樣本的準(zhǔn)確性和精確度。然而，由于個(gè)別實(shí)驗(yàn)室條件的影響，所有模型在可檢測(cè)范圍的最低端和最高端的準(zhǔn)確性和精確度都是有限的。因此，在解釋分析物響應(yīng)變得非線性時(shí)所得出的結(jié)果時(shí)，應(yīng)始終謹(jǐn)慎。

胰島素ELISA文獻(xiàn)參考：

Finlay JWA, Dillard RF. Appropriate Calibration Curve Fitting in Ligand Binding Assays. AAPS Journal. 2007; 9(2): E260-E267.