TGFβ/Activin A響應(yīng)型熒光素酶報(bào)告基因HEK293細(xì)胞系是一種表達(dá)螢火蟲(chóng)熒光素酶報(bào)告基因的HEK293細(xì)胞系，該報(bào)告基因受SMAD響應(yīng)元件（SMAD結(jié)合元件，SBE）的控制。該細(xì)胞系監(jiān)測(cè)TGFβ（轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β）/SMAD信號(hào)通路的活性。

該細(xì)胞系已通過(guò)人類TGFβ1激活以及對(duì)TGFβ1超家族其他細(xì)胞因子如Activin A、GDF-8/Myostatin和GDF-11/BMP-11的響應(yīng)進(jìn)行了驗(yàn)證。人類TGFβ1和Activin A誘導(dǎo)的熒光素酶活性可被SB525334降低，SB525334是TGFβ1受體的抑制劑。Activin A、GDF-8/Myostatin和GDF-11/BMP-11誘導(dǎo)的熒光素酶活性可被Bimagrumab降低，Bimagrumab是ActRII的抗體。Activin A誘導(dǎo)的熒光素酶活性也可被Activin Blocker降低，Activin Blocker是ActRIIA-Fc融合蛋白，以及抗TGFβ抗體。

背景

TGFβ信號(hào)通路參與了多種細(xì)胞過(guò)程，如生長(zhǎng)和分化、細(xì)胞周期停滯和免疫調(diào)節(jié)。TGFβ信號(hào)與心臟病、癌癥、阿爾茨海默病等疾病有關(guān)。TGFβ蛋白結(jié)合到細(xì)胞表面受體，啟動(dòng)一個(gè)信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)，導(dǎo)致信號(hào)蛋白SMAD2（母親反對(duì)十指發(fā)育同源物2）和SMAD3的磷酸化和激活，然后與SMAD4形成復(fù)合物。SMAD復(fù)合物被轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核，并結(jié)合到目標(biāo)基因啟動(dòng)子中的SMAD結(jié)合元件（SBE），導(dǎo)致TGFβ/SMAD響應(yīng)基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)。理解和調(diào)控這一通路可以為癌癥治療的方法開(kāi)發(fā)提供重要線索。

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應(yīng)用

? 監(jiān)測(cè)TGFβ信號(hào)通路的激活。

? 篩選調(diào)節(jié)TGFβ/SMAD信號(hào)通路的化合物。

細(xì)胞解凍

1. 在37°C水浴中搖晃冷凍細(xì)胞瓶大約60秒。一旦細(xì)胞解凍（可能比60秒稍快或稍慢），迅速將瓶中全部?jī)?nèi)容物轉(zhuǎn)移到含有10毫升預(yù)溫的解凍培養(yǎng)基1的試管中。

注意：在37°C水浴中放置過(guò)久會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞活性迅速喪失。

2. 立即以300 x g的速度離心細(xì)胞5分鐘，去除培養(yǎng)基，并在5毫升預(yù)溫的解凍培養(yǎng)基1中重懸細(xì)胞。

3. 將重懸的細(xì)胞轉(zhuǎn)移到T25或T75培養(yǎng)瓶中，并在37°C的5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

4. 培養(yǎng)24小時(shí)后，檢查細(xì)胞附著和活性。更換為新鮮的解凍培養(yǎng)基1，并在37°C的5% CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，直到細(xì)胞準(zhǔn)備好傳代。

5. 細(xì)胞應(yīng)在完全融合前傳代。在第一次傳代及后續(xù)傳代中，使用生長(zhǎng)培養(yǎng)基1B。

細(xì)胞傳代

1. 抽吸培養(yǎng)基，用無(wú)Ca2+/Mg2+的磷酸鹽緩沖液（PBS）沖洗細(xì)胞，并用0.05%胰蛋白酶/EDTA從培養(yǎng)容器中分離細(xì)胞。

2. 一旦細(xì)胞分離，加入生長(zhǎng)培養(yǎng)基1B并轉(zhuǎn)移到試管中。

3. 以300 x g的速度離心細(xì)胞5分鐘，去除培養(yǎng)基，并在生長(zhǎng)培養(yǎng)基1B中重懸細(xì)胞。

4. 按照推薦的次培養(yǎng)比例1:5至1:10，每周一次或兩次接種到新的培養(yǎng)容器中。

注意：解凍后和細(xì)胞密度低時(shí)，細(xì)胞可能生長(zhǎng)速度較慢。在這些情況下，建議以1:4的比例分離細(xì)胞。經(jīng)過(guò)幾次傳代后，細(xì)胞生長(zhǎng)速度增加，可以使用更高的比例進(jìn)行分離。

細(xì)胞冷凍

1. 抽吸培養(yǎng)基，用無(wú)Ca2+/Mg2+的PBS沖洗細(xì)胞，并用0.05%胰蛋白酶/EDTA從培養(yǎng)容器中分離細(xì)胞。

2. 一旦細(xì)胞分離，加入生長(zhǎng)培養(yǎng)基1B并計(jì)數(shù)細(xì)胞。

3. 以300 x g的速度離心細(xì)胞5分鐘，去除培養(yǎng)基，并在4°C的細(xì)胞冷凍培養(yǎng)基（BPS Bioscience #79796）中重懸細(xì)胞至約2 x 10^6細(xì)胞/毫升。

4. 將1毫升的細(xì)胞懸浮液分裝到每個(gè)冷凍小瓶中。將小瓶放置在保溫容器中緩慢冷卻，并在-80°C下過(guò)夜保存。

5. 次日將小瓶轉(zhuǎn)移到液氮中進(jìn)行長(zhǎng)期儲(chǔ)存。

注意：建議在早期傳代時(shí)擴(kuò)增細(xì)胞并至少冷凍10瓶以備將來(lái)使用。

數(shù)據(jù)展示：

圖：TGFβ1激動(dòng)劑在TGFβ/Activin A響應(yīng)型熒光素酶報(bào)告基因HEK293細(xì)胞系中誘導(dǎo)報(bào)告基因激活。

TGFβ/Activin A響應(yīng)型熒光素酶報(bào)告基因HEK293細(xì)胞與逐漸增加濃度的人類TGFβ1（#90900）共同孵育18小時(shí)。使用ONE-Step?熒光素酶檢測(cè)系統(tǒng)（#60690）測(cè)量熒光素酶活性。結(jié)果表示為與無(wú)激動(dòng)劑的細(xì)胞活性相比，SBE熒光素酶報(bào)告基因表達(dá)的倍數(shù)誘導(dǎo)。

文獻(xiàn)參考：

Moustakas A, et al., 2001 J. Cell Science. 114: 4359-69.

BPS Bioscience是一家通過(guò)ISO 9001:2015認(rèn)證的生命科學(xué)領(lǐng)域的供應(yīng)商，公司一直致力于開(kāi)發(fā)藥物研發(fā)領(lǐng)域的重組蛋白酶、蛋白酶活性/抑制劑篩選試劑盒和慢病毒等工具。公司由Henry Zhu博士于2005年創(chuàng)立，從創(chuàng)立至今一直致力于提供藥物研發(fā)領(lǐng)域的創(chuàng)新解決方案，以推動(dòng)新的藥物發(fā)現(xiàn)。公司主要關(guān)注的領(lǐng)域包括免疫療法、表觀遺傳學(xué)、新型冠狀病毒、CRISPR、細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等，主要提供激酶、磷酸二酯酶、磷酸酶、組蛋白去甲基化酶、組蛋白甲基化轉(zhuǎn)移酶、HDACs、聚ADP核糖聚合酶等。 

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