這條細胞系是通過從穩(wěn)定轉染Cas9慢病毒（BPS Bioscience #78066）的細胞群體中進行限制稀釋得到的。基于Cas9表達篩選出的孤立克隆，以獲得高表達的細胞系。表達的Cas9蛋白包含一個C末端FLAG標簽。

背景

Cas9（化膿性鏈球菌CRISPR相關蛋白9）是一種內切酶，當被sgRNA（單導向RNA）引導到特定的DNA序列時，會在DNA中引入雙鏈斷裂。這種雙鏈斷裂在哺乳動物細胞中通過非同源末端連接或同源重組進行修復。非同源末端連接通常導致在切割位點處刪除或插入幾個堿基對，當導致移碼突變時，會引起目標基因的功能失活。表達Cas9的HEK293細胞可以通過轉導或電穿孔sgRNA針對感興趣的基因，快速生成敲除細胞池或細胞系。

作為BPS Bioscience在中國的區(qū)域總代理，艾美捷科技強烈推薦BPS Bioscience熱銷產(chǎn)品Cas9-表達 HEK293 細胞系。產(chǎn)品僅用于科研，不可用于臨床診斷。

應用

1. 在HEK293細胞中快速生成敲除細胞池或細胞系。

2. 在表達Cas9的HEK293細胞中實施sgRNA篩選。

推薦細胞培養(yǎng)條件

冷凍細胞：

1. 準備一個T-75培養(yǎng)瓶，加入20毫升預熱的解凍培養(yǎng)基6（不含普魯霉素）。

2. 在37°C水浴中不斷緩慢搖晃以快速解凍細胞。

3. 用70%乙醇清潔瓶外后，立即將全部內容物轉移到解凍培養(yǎng)基6（不含普魯霉素）。避免上下吹打，輕輕搖晃培養(yǎng)瓶以分散細胞。

4. 在37°C、5% CO2的濕潤培養(yǎng)箱中培養(yǎng)細胞。

5. 培養(yǎng)24-48小時后，更換為新鮮的生長培養(yǎng)基6C（含普魯霉素），不要擾動已附著的細胞。

6. 繼續(xù)每2-3天更換一次培養(yǎng)基，直到細胞達到所需的密度。

傳代：

1. 當細胞達到90%密度時，去除生長培養(yǎng)基6C，并用不含鎂或鈣的PBS洗滌兩次。

2. 用2-3毫升0.25%胰蛋白酶/EDTA處理細胞，并在37°C下培養(yǎng)2-3分鐘。

3. 通過光學顯微鏡確認細胞脫落后，加入10毫升預熱的生長培養(yǎng)基6C，并輕輕上下吹打以分散細胞團。

4. 將細胞轉移到15毫升錐形管中，并以200 x g的速度離心5分鐘。

5. 去除培養(yǎng)基，并將細胞在10毫升預熱的生長培養(yǎng)基6C中重懸。

6. 將1毫升細胞懸液分配到新的T75培養(yǎng)瓶中，其中含有預熱的9毫升生長培養(yǎng)基6C（推薦的傳代比例為1:2至1:10）。

7. 在37°C、5% CO2的濕潤培養(yǎng)箱中培養(yǎng)細胞。

冷凍保存：

1. 當細胞達到90%密度時，如上所述使用胰蛋白酶從培養(yǎng)板中移除細胞，離心細胞并從沉淀中去除培養(yǎng)基。

2. 將細胞在冷凍培養(yǎng)基（FBS中的10% DMSO）中重懸。

3. 使用減慢速率冷凍盒（每分鐘下降-0.5°C至-1°C）將細胞冷凍至-80°C，然后將細胞移至液氮中長期儲存。

已證明細胞至少穩(wěn)定15代；BPS建議盡早準備冷凍庫存，以免細胞使用超過20代。

圖1. HEK293細胞內Cas9表達的流式細胞儀分析。

細胞用PE標記的抗FLAG抗體（BioLegend，#637309）染色，并通過流式細胞儀分析。親本HEK293細胞以綠色顯示，表達Cas9的HEK293細胞系（BPS Bioscience，#78166）以藍色顯示。

BPS Bioscience是一家通過ISO 9001:2015認證的生命科學領域的供應商，公司一直致力于開發(fā)藥物研發(fā)領域的重組蛋白酶、蛋白酶活性/抑制劑篩選試劑盒和慢病毒等工具。公司由Henry Zhu博士于2005年創(chuàng)立，從創(chuàng)立至今一直致力于提供藥物研發(fā)領域的創(chuàng)新解決方案，以推動新的藥物發(fā)現(xiàn)。公司主要關注的領域包括免疫療法、表觀遺傳學、新型冠狀病毒、CRISPR、細胞信號轉導等，主要提供激酶、磷酸二酯酶、磷酸酶、組蛋白去甲基化酶、組蛋白甲基化轉移酶、HDACs、聚ADP核糖聚合酶等。 

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