重組穩(wěn)定HEK293細(xì)胞系恒定表達(dá)帶有FLAG標(biāo)簽的Cas9核酸酶和CopGFP（Pontellina plumata綠色熒光蛋白），這些蛋白已被穩(wěn)定整合到染色體19上的AAVS1安全港位點。當(dāng)轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)導(dǎo)單導(dǎo)向RNA（sgRNAs）時，該細(xì)胞系將在目標(biāo)基因組位點維持雙鏈DNA斷裂（DSBs）。

Cas9的表達(dá)由CBh啟動子驅(qū)動，而CopGFP由EF1A啟動子驅(qū)動。圖1中展示的聯(lián)合DNA片段（CBh-Cas9-bGH Poly A-EF1A-CopGFP-T2A-Puro-SV40 Poly A）使用CRISPR/Cas9技術(shù)整合到了AAVS1安全港位點。該構(gòu)建還含有一個普魯霉素抗性基因。

通過限制稀釋克隆細(xì)胞以獲得單克隆群體。由于避免了Cas9/GFP在HEK293基因組中隨機(jī)整合所帶來的不良影響，該細(xì)胞系的行為類似于親本HEK293細(xì)胞。

背景

人類染色體19上的AAVS1（也稱為PPP1R12C位點）是一個經(jīng)過充分驗證的“安全港”位點，用于承載DNA轉(zhuǎn)基因。AAVS1具有開放的染色質(zhì)結(jié)構(gòu)，并且具有轉(zhuǎn)錄能力。最重要的是，通過插入DNA轉(zhuǎn)基因破壞AAVS1位點對細(xì)胞沒有已知的不良影響。與使用其他方法（如慢病毒感染或細(xì)胞轉(zhuǎn)染）獲得的隨機(jī)整合相比，特別針對AAVS1位點是一個主要優(yōu)勢，因為這些方法可能會導(dǎo)致插入性突變或破壞重要基因或細(xì)胞過程。GFP（綠色熒光蛋白）呈現(xiàn)綠色熒光，最初在水母Aequorea Victoria中發(fā)現(xiàn)。后來在Pontellina plumata中發(fā)現(xiàn)了GFP（CopGFP），它具有超亮和快速成熟的特點。熒光蛋白的存在允許通過流式細(xì)胞儀或熒光顯微鏡進(jìn)行細(xì)胞識別和定量，以及在體內(nèi)進(jìn)行定位研究，提供簡單的檢測讀出。

作為BPS Bioscience在中國的區(qū)域總代理，艾美捷科技強(qiáng)烈推薦BPS Bioscience熱銷產(chǎn)品Cas9/GFP 安全港 HEK293 細(xì)胞系。產(chǎn)品僅用于科研，不可用于臨床診斷。

應(yīng)用

用于基因敲除、轉(zhuǎn)基因敲入、誘變、轉(zhuǎn)基因整合或其他與基因組編輯相關(guān)的應(yīng)用。

細(xì)胞培養(yǎng)協(xié)議

細(xì)胞復(fù)蘇

1. 在37°C水浴中旋轉(zhuǎn)冷凍細(xì)胞瓶大約60秒。細(xì)胞解凍后（可能比60秒稍快或稍慢），迅速將瓶內(nèi)的全部內(nèi)容轉(zhuǎn)移到含有10毫升預(yù)熱的解凍培養(yǎng)基6的管中。在37°C水浴中放置細(xì)胞過久會導(dǎo)致細(xì)胞活力迅速下降。

2. 立即以300 x g的速度離心細(xì)胞5分鐘，去除培養(yǎng)基，并在5毫升預(yù)熱的解凍培養(yǎng)基6中重懸細(xì)胞。

3. 將重懸的細(xì)胞轉(zhuǎn)移到T25或T75培養(yǎng)瓶中，并在37°C、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

4. 培養(yǎng)24小時后，檢查細(xì)胞附著和活力。更換為新鮮的解凍培養(yǎng)基6，并繼續(xù)在37°C、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，直到細(xì)胞準(zhǔn)備好傳代。

5. 在細(xì)胞完全融合之前應(yīng)進(jìn)行傳代。

細(xì)胞傳代

1. 吸去培養(yǎng)基，用不含Ca2+/Mg2+的磷酸鹽緩沖液（PBS）洗滌細(xì)胞，并用0.05%胰蛋白酶/EDTA從培養(yǎng)容器中分離細(xì)胞。

2. 一旦細(xì)胞分離，加入解凍培養(yǎng)基6并轉(zhuǎn)移到管中。

3. 以300 x g的速度離心細(xì)胞5分鐘，去除培養(yǎng)基，并在解凍培養(yǎng)基6中重懸細(xì)胞。

4. 按推薦的亞培養(yǎng)比例1:6至1:8每周一次或兩次播種到新的培養(yǎng)容器中。

細(xì)胞冷凍

1. 吸去培養(yǎng)基，用不含Ca2+/Mg2+的PBS洗滌細(xì)胞，并用0.05%胰蛋白酶/EDTA從培養(yǎng)容器中分離細(xì)胞。

2. 一旦細(xì)胞分離，加入解凍培養(yǎng)基6并計數(shù)細(xì)胞。

3. 以300 x g的速度離心細(xì)胞5分鐘，去除培養(yǎng)基，并在4°C細(xì)胞冷凍培養(yǎng)基（BPS Bioscience #79796）中重懸細(xì)胞，濃度約為2 x 10^6細(xì)胞/毫升。

4. 將1毫升的細(xì)胞懸浮液分裝到冷凍管中。將管放入絕緣容器中緩慢冷卻，并在-80°C下過夜儲存。

5. 次日將管轉(zhuǎn)移到液氮中儲存。

注意：建議在早期傳代擴(kuò)展細(xì)胞并至少冷凍10管以備將來使用。

圖：通過PCR（聚合酶鏈反應(yīng)）穩(wěn)定整合到AAVS1安全港位點。

在整合的5'端，跨越染色體19上的AAVS1位點和CBh Cas9整合開始的區(qū)域通過PCR擴(kuò)增，預(yù)計大小為1.1 kb。在整合的3'端，跨越EF1α GFP-Puro整合和染色體19上的AAVS1位點的區(qū)域通過PCR擴(kuò)增，預(yù)計大小為1.2 kb。

BPS Bioscience是一家通過ISO 9001:2015認(rèn)證的生命科學(xué)領(lǐng)域的供應(yīng)商，公司一直致力于開發(fā)藥物研發(fā)領(lǐng)域的重組蛋白酶、蛋白酶活性/抑制劑篩選試劑盒和慢病毒等工具。公司由Henry Zhu博士于2005年創(chuàng)立，從創(chuàng)立至今一直致力于提供藥物研發(fā)領(lǐng)域的創(chuàng)新解決方案，以推動新的藥物發(fā)現(xiàn)。公司主要關(guān)注的領(lǐng)域包括免疫療法、表觀遺傳學(xué)、新型冠狀病毒、CRISPR、細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等，主要提供激酶、磷酸二酯酶、磷酸酶、組蛋白去甲基化酶、組蛋白甲基化轉(zhuǎn)移酶、HDACs、聚ADP核糖聚合酶等。 

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