這一細(xì)胞系已被工程化，用于CRISPR協(xié)同激活介質(zhì)（SAM）系統(tǒng)，以誘導(dǎo)任何感興趣基因的轉(zhuǎn)錄激活和表達(dá)。細(xì)胞穩(wěn)定表達(dá)一種突變的dCas9（化膿性鏈球菌CRISPR相關(guān)蛋白9），缺乏任何內(nèi)切核酸酶活性，與轉(zhuǎn)錄激活因子VP64融合。穩(wěn)定的dCas9-VP64表達(dá)通過(guò)Blasticidin抗性維持。細(xì)胞還穩(wěn)定表達(dá)與MS2標(biāo)簽融合的P65（轉(zhuǎn)錄因子p65，或核因子NF-κB p65）和HSF1（熱休克因子1），通過(guò)Hygromycin抗性維持。當(dāng)這些細(xì)胞被轉(zhuǎn)染以MS2標(biāo)簽的sgRNA，靶向感興趣基因的啟動(dòng)子區(qū)域時(shí)，dCas9-VP64和MS2-P65-HSF1被招募到基因組DNA并開始轉(zhuǎn)錄，誘導(dǎo)所需基因的表達(dá)。

作為BPS Bioscience在中國(guó)的區(qū)域總代理，艾美捷科技強(qiáng)烈推薦BPS Bioscience熱銷產(chǎn)品CRISPRa (SAM) HEK293 細(xì)胞系。產(chǎn)品僅用于科研，不可用于臨床診斷。

應(yīng)用

1. 快速生成CRISPR激活的HEK293細(xì)胞池或細(xì)胞系

2. 在HEK293細(xì)胞中實(shí)施sgRNA CRISPRa篩選

推薦培養(yǎng)條件

1. 建議在37?C水浴中快速解凍液氮中的冷凍細(xì)胞，然后將小瓶的全部?jī)?nèi)容轉(zhuǎn)移到含有10毫升解凍培養(yǎng)基6（不含Hygromycin或Blasticidin）的試管中。

2. 然后離心細(xì)胞，去除上清液，并用5毫升預(yù)溫的解凍培養(yǎng)基6（不含Hygromycin或Blasticidin）重懸細(xì)胞。

3. 將重懸的細(xì)胞轉(zhuǎn)移到T25培養(yǎng)瓶中，并在37?C和5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

4. 培養(yǎng)24小時(shí)后，再加入額外的3-4毫升解凍培養(yǎng)基6（不含Hygromycin或Blasticidin）。

5. 在第一次傳代時(shí)，切換到含有Hygromycin和Blasticidin的生長(zhǎng)培養(yǎng)基6D。

傳代：

1. 當(dāng)細(xì)胞達(dá)到90%融合時(shí)，去除生長(zhǎng)培養(yǎng)基，并用不含鎂或鈣的PBS沖洗兩次。

2. 向細(xì)胞中加入2-3毫升0.25%胰酶/EDTA，并在37°C下培養(yǎng)2-3分鐘。

3. 通過(guò)光學(xué)顯微鏡確認(rèn)細(xì)胞脫落后，加入10毫升預(yù)溫的生長(zhǎng)培養(yǎng)基6D，并輕輕上下吹打以分散細(xì)胞團(tuán)。

4. 將細(xì)胞轉(zhuǎn)移到15毫升錐形管中，并以200 x g的速度離心5分鐘。

5. 去除培養(yǎng)基，并用10毫升預(yù)溫的生長(zhǎng)培養(yǎng)基6D重懸細(xì)胞。

6. 將2毫升細(xì)胞懸浮液分裝到新的T75培養(yǎng)瓶中，其中含有預(yù)溫的18毫升生長(zhǎng)培養(yǎng)基6D（推薦傳代比例為1:2至1:10）。

7. 在濕度控制的37°C培養(yǎng)箱中，含有5% CO2的條件下培養(yǎng)細(xì)胞。

冷凍保存：

1. 當(dāng)細(xì)胞達(dá)到90%融合時(shí)，如上所述使用胰酶從培養(yǎng)板中移除細(xì)胞，離心細(xì)胞并從沉淀中去除培養(yǎng)基。

2. 在含有10% DMSO的FBS中的冷凍培養(yǎng)基中重懸細(xì)胞。

3. 使用減速冷凍盒（每分鐘下降-0.5°C至-1°C）將細(xì)胞冷凍至-80°C，然后將細(xì)胞轉(zhuǎn)移到液氮中長(zhǎng)期保存。

已證明細(xì)胞至少穩(wěn)定15代；BPS建議準(zhǔn)備冷凍庫(kù)存，以便細(xì)胞使用不超過(guò)20代。

圖1. CRISPRa（SAM）HEK293細(xì)胞中PD-1的誘導(dǎo)。

CRISPRa（SAM）HEK293細(xì)胞被sgRNA-MS2慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)，靶向PD-1（BPS Bioscience，#78190）以誘導(dǎo)PD-1表達(dá)。在電穿孔后72小時(shí)（無(wú)選擇）用PE標(biāo)記的抗PD-1抗體（BioLegend，#637309）染色，并用流式細(xì)胞儀分析。親本CRISPRa（SAM）HEK293細(xì)胞以藍(lán)色顯示，轉(zhuǎn)染的CRISPRa（SAM）HEK293細(xì)胞以綠色顯示。

BPS Bioscience是一家通過(guò)ISO 9001:2015認(rèn)證的生命科學(xué)領(lǐng)域的供應(yīng)商，公司一直致力于開發(fā)藥物研發(fā)領(lǐng)域的重組蛋白酶、蛋白酶活性/抑制劑篩選試劑盒和慢病毒等工具。公司由Henry Zhu博士于2005年創(chuàng)立，從創(chuàng)立至今一直致力于提供藥物研發(fā)領(lǐng)域的創(chuàng)新解決方案，以推動(dòng)新的藥物發(fā)現(xiàn)。公司主要關(guān)注的領(lǐng)域包括免疫療法、表觀遺傳學(xué)、新型冠狀病毒、CRISPR、細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等，主要提供激酶、磷酸二酯酶、磷酸酶、組蛋白去甲基化酶、組蛋白甲基化轉(zhuǎn)移酶、HDACs、聚ADP核糖聚合酶等。 

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