重組HEK293細(xì)胞系穩(wěn)定表達(dá)全長(zhǎng)人類降鈣素受體樣受體（CALCRL/CRLR/CLR；登錄號(hào)：NM_005795）和由多聚化的cAMP反應(yīng)元件（CRE）控制的螢火蟲熒光素酶。這一細(xì)胞系可用于通過熒光素酶報(bào)告基因活性作為讀出，測(cè)量CGRP受體激動(dòng)劑和拮抗劑的EC50和IC50。

背景

降鈣素基因相關(guān)肽（CGRP）受體是一種由三個(gè)組分構(gòu)成的G蛋白偶聯(lián)受體：降鈣素受體樣受體（CALCRL）、受體活性調(diào)節(jié)蛋白（RAMP1）和CGRP受體組分蛋白（CRCP）。RAMP1對(duì)于降鈣素樣受體向質(zhì)膜的轉(zhuǎn)運(yùn)和與CGRP激動(dòng)劑的偶聯(lián)是必需的。CRCP參與CGRP受體與G蛋白之間的關(guān)聯(lián)。在配體結(jié)合后，復(fù)合物與G蛋白相互作用，Gαs亞基從復(fù)合物中解離并激活腺苷酸環(huán)化酶，產(chǎn)生cAMP。細(xì)胞內(nèi)cAMP濃度的升高刺激cAMP依賴的信號(hào)通路，最終導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄因子cAMP反應(yīng)元件結(jié)合蛋白（CREB）結(jié)合到CRE啟動(dòng)子并誘導(dǎo)基因表達(dá)。

圖1：CGRP的作用機(jī)制。

臨床前證據(jù)表明，在偏頭痛期間，三叉神經(jīng)節(jié)中激活的感覺神經(jīng)元在其位于腦膜內(nèi)的投射神經(jīng)末梢釋放CGRP。釋放的CGRP隨后結(jié)合并激活CGRP受體，引起血管擴(kuò)張和血漿外滲。進(jìn)一步的證據(jù)來自觀察到靜脈注射α-CGRP會(huì)在易感個(gè)體中引起頭痛。最近在理解CGRP在偏頭痛中的作用方面取得的突破，促進(jìn)了一類新的CGRP拮抗劑生物制劑的開發(fā)，這些生物制劑有望比傳統(tǒng)藥物治療有顯著改善。

作為BPS Bioscience在中國的區(qū)域總代理，艾美捷科技強(qiáng)烈推薦BPS Bioscience熱銷產(chǎn)品CGRPR/CRE 熒光素酶報(bào)告基因 HEK293 細(xì)胞系。產(chǎn)品僅用于科研，不可用于臨床診斷。

應(yīng)用

? 在免疫療法研究和藥物發(fā)現(xiàn)中篩選CGRP受體的激活劑或抑制劑。

? 篩選抗CGRP抗體。

細(xì)胞培養(yǎng)協(xié)議

注意：HEK293細(xì)胞源自人類材料，因此建議采取適當(dāng)?shù)陌踩A(yù)防措施。

細(xì)胞解凍

1. 從液氮儲(chǔ)存中取出一個(gè)細(xì)胞小瓶。在準(zhǔn)備解凍前保持在干冰上。

2. 準(zhǔn)備解凍時(shí)，在37°C水浴中搖晃裝有冷凍細(xì)胞的小瓶大約60秒。一旦細(xì)胞解凍（可能比60秒稍快或稍慢），迅速將小瓶的全部?jī)?nèi)容轉(zhuǎn)移到一個(gè)空的50毫升錐形管中。

注意：在37°C的水浴中放置細(xì)胞過久會(huì)導(dǎo)致活性迅速喪失。

3. 使用10毫升的血清學(xué)移液管，緩慢地向含有細(xì)胞的錐形管中加入10毫升預(yù)溫的解凍培養(yǎng)基1。解凍培養(yǎng)基1應(yīng)滴加同時(shí)輕輕搖晃錐形管，以實(shí)現(xiàn)溫和混合并避免滲透沖擊。

4. 立即以300 x g的速度離心細(xì)胞5分鐘，去除培養(yǎng)基并用5毫升預(yù)溫的解凍培養(yǎng)基1重懸細(xì)胞。

5. 將重懸的細(xì)胞轉(zhuǎn)移到T25或T75培養(yǎng)瓶中，并在37°C和5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

6. 培養(yǎng)24小時(shí)后，檢查細(xì)胞附著和活性。更換培養(yǎng)基為新鮮的解凍培養(yǎng)基1，并繼續(xù)在37°C和5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，直到細(xì)胞準(zhǔn)備好分裂。

7. 細(xì)胞應(yīng)在完全融合前進(jìn)行傳代。在第一次傳代和后續(xù)傳代中，使用生長(zhǎng)培養(yǎng)基1G。

細(xì)胞傳代

1. 抽吸培養(yǎng)基，用無Ca2+/Mg2+的磷酸鹽緩沖液（PBS）沖洗細(xì)胞，并用0.05%胰酶/EDTA從培養(yǎng)容器中分離細(xì)胞。

2. 一旦細(xì)胞分離，加入生長(zhǎng)培養(yǎng)基1G并轉(zhuǎn)移到試管中。

3. 以300 x g的速度離心細(xì)胞5分鐘，去除培養(yǎng)基并用生長(zhǎng)培養(yǎng)基1G重懸細(xì)胞。

4. 按照推薦的1:10至1:20的傳代比例，每周或每?jī)芍軐⒓?xì)胞種植到新的培養(yǎng)容器中。

細(xì)胞冷凍

1. 抽吸培養(yǎng)基，用無Ca2+/Mg2+的PBS沖洗細(xì)胞，并用0.05%胰酶/EDTA從培養(yǎng)容器中分離細(xì)胞。

2. 一旦細(xì)胞分離，加入生長(zhǎng)培養(yǎng)基1G并計(jì)數(shù)細(xì)胞。

3. 以300 x g的速度離心細(xì)胞5分鐘，去除培養(yǎng)基并在4°C的細(xì)胞冷凍培養(yǎng)基（BPS Bioscience #79796）中重懸細(xì)胞，細(xì)胞濃度約為2 x 10^6個(gè)細(xì)胞/毫升。

4. 將1毫升的細(xì)胞懸浮液分裝到每個(gè)冷凍小瓶中。將小瓶放入保溫容器中緩慢冷卻，并在-80°C下過夜保存。

5. 次日將小瓶轉(zhuǎn)移到液氮中長(zhǎng)期保存。

注意：建議在早期傳代時(shí)擴(kuò)增細(xì)胞并至少冷凍10個(gè)小瓶以備將來使用。

圖2：CGRPR/CRE熒光素酶報(bào)告基因HEK293細(xì)胞系中人類CALCRL的細(xì)胞表面表達(dá)。

CGRPR/CRE熒光素酶報(bào)告基因HEK293細(xì)胞或CRE熒光素酶報(bào)告基因HEK293親本細(xì)胞用一級(jí)抗CALCRL抗體（Aviva #APR42260）和PE標(biāo)記的驢抗兔二級(jí)抗體（Biolegend #406421）染色，并通過流式細(xì)胞儀分析。Y軸代表細(xì)胞數(shù)量百分比。X軸表示PE的強(qiáng)度。

BPS Bioscience是一家通過ISO 9001:2015認(rèn)證的生命科學(xué)領(lǐng)域的供應(yīng)商，公司一直致力于開發(fā)藥物研發(fā)領(lǐng)域的重組蛋白酶、蛋白酶活性/抑制劑篩選試劑盒和慢病毒等工具。公司由Henry Zhu博士于2005年創(chuàng)立，從創(chuàng)立至今一直致力于提供藥物研發(fā)領(lǐng)域的創(chuàng)新解決方案，以推動(dòng)新的藥物發(fā)現(xiàn)。公司主要關(guān)注的領(lǐng)域包括免疫療法、表觀遺傳學(xué)、新型冠狀病毒、CRISPR、細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等，主要提供激酶、磷酸二酯酶、磷酸酶、組蛋白去甲基化酶、組蛋白甲基化轉(zhuǎn)移酶、HDACs、聚ADP核糖聚合酶等。 

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