重組HEK-293細胞表達在SRE響應元件控制下的增強型綠色熒光蛋白（eGFP）。這種細胞系已經驗證了其對EGF或血清刺激以及ERK信號通路抑制劑的處理的反應。

背景：

MAPK/ERK信號通路是細胞生長和分化的關鍵調節(jié)器。它可以被多種細胞外刺激激活，包括促有絲分裂素、生長因子和細胞因子。在刺激后，MEK1/2磷酸化并激活ERK1/2。激活的ERK轉移到細胞核中，在那里它磷酸化并激活轉錄因子。三元復合體因子（TCFs），包括Elk1，是ERK1/2轉錄因子底物中最好表征的之一。當被ERK1/2磷酸化時，Elk1與血清反應因子（SRF）形成復合體，并結合到血清反應元件（SRE），導致多種有絲分裂原誘導基因的表達。

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細胞培養(yǎng)所需的培養(yǎng)基：

解凍培養(yǎng)基1（BPS Bioscience #60187）：

MEM培養(yǎng)基，補充10% FBS、1%非必需氨基酸、1 mM Na、1%青霉素/鏈霉素

生長培養(yǎng)基1J（BPS Bioscience #79552）：

MEM培養(yǎng)基，補充10% FBS、1%非必需氨基酸、1 mM Na、1%青霉素/鏈霉素和500 ?g/ml的遺傳霉素/G418

檢測培養(yǎng)基1：解凍培養(yǎng)基1（BPS Bioscience #60187）

檢測培養(yǎng)基1B（BPS Bioscience #79617）：

MEM培養(yǎng)基，補充0.5% FBS、1%非必需氨基酸、1 mM Na焦磷酸鹽、1%青霉素/鏈霉素

細胞培養(yǎng)協(xié)議：

細胞解凍：

1. 為了解凍細胞，建議在37°C水浴中將冷凍細胞旋轉30-40秒，然后用1-2 ml解凍培養(yǎng)基1完全解凍細胞。將整個瓶中的內容轉移到含有10 ml解凍培養(yǎng)基1（不含遺傳霉素/G418）的管中。

2. 離心細胞，去除上清液，然后在5 ml預熱的解凍培養(yǎng)基1（不含遺傳霉素/G418）中重懸細胞。

3. 將重懸的細胞轉移到T25或T75培養(yǎng)瓶中，并在37°C、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

4. 培養(yǎng)24小時后，檢查細胞附著和活力。更換為新鮮的解凍培養(yǎng)基1（不含遺傳霉素/G418），并在37°C、5% CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，直到細胞準備好分裂。

5. 細胞應在完全融合前分裂。在第一次傳代時，切換到生長培養(yǎng)基1J（含遺傳霉素/G418）。

細胞傳代：

1. 傳代細胞時，去除培養(yǎng)基，用磷酸鹽緩沖液（PBS）沖洗細胞，并用0.05%胰酶/EDTA從培養(yǎng)容器中分離細胞。

2. 分離后，加入生長培養(yǎng)基1J（含遺傳霉素/G418），轉移到管中，離心細胞，然后在生長培養(yǎng)基1J中重懸細胞，并將適當的細胞懸浮液等分到新的培養(yǎng)容器中。次培養(yǎng)比例：每周1:6至1:8或每周兩次。

細胞冷凍：

1. 為了冷凍保存細胞，去除培養(yǎng)基，用磷酸鹽緩沖液（PBS）沖洗細胞，并用0.05%胰酶/EDTA從培養(yǎng)容器中分離細胞。

2. 分離后，加入解凍培養(yǎng)基1（不含遺傳霉素/G418），計數細胞，然后轉移到管中，離心細胞，并在4°C冷凍培養(yǎng)基（BPS Bioscience #79796或10% DMSO + 90% FBS）中重懸，細胞濃度約為2 x 10^6細胞/ml。

3. 將1 ml的細胞等分到冷凍瓶中。將瓶子放入絕緣容器中緩慢冷卻，并在-80°C下過夜保存。

4. 次日轉移到液氮中保存。

注意：建議擴展細胞并在早期傳代時至少冷凍10瓶細胞以備將來使用。

SRE-eGFP報告基因HEK293細胞對EGF或血清的反應：

1. 從生長培養(yǎng)基1J中收獲SRE-eGFP報告基因HEK293細胞，并將細胞以每孔約50,000個細胞的密度播種到24孔組織培養(yǎng)板中，每孔0.5 ml的解凍培養(yǎng)基1（見上文）。

2. 在37°C、CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)細胞過夜。

3. 從孔中去除培養(yǎng)基，并用0.5 mL的檢測培養(yǎng)基1B（含0.5% FBS）替換。

4. 在37°C、CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)細胞72小時。

5. 從孔中去除培養(yǎng)基，并用檢測培養(yǎng)基1B（0.5% FBS）或檢測培養(yǎng)基1（10% FBS）中的理想劑量的人重組EGF替換。

6. 在37°C、CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)細胞48小時。

7. 使用熒光顯微鏡或流式細胞儀（Ex/Em=488/510 nm）分析eGFP表達。

實驗時間：SRE-EGFP報告HEK293細胞對EGF或血清的反應

圖1. EGF或血清誘導SRE-eGFP報告基因在SRE-eGFP報告基因HEK293中的表達。報告的數據來自流式細胞儀分析，并以FITC通道的均值熒光強度信號呈現，每個條件3次重復。

BPS Bioscience是一家通過ISO 9001:2015認證的生命科學領域的供應商，公司一直致力于開發(fā)藥物研發(fā)領域的重組蛋白酶、蛋白酶活性/抑制劑篩選試劑盒和慢病毒等工具。公司由Henry Zhu博士于2005年創(chuàng)立，從創(chuàng)立至今一直致力于提供藥物研發(fā)領域的創(chuàng)新解決方案，以推動新的藥物發(fā)現。公司主要關注的領域包括免疫療法、表觀遺傳學、新型冠狀病毒、CRISPR、細胞信號轉導等，主要提供激酶、磷酸二酯酶、磷酸酶、組蛋白去甲基化酶、組蛋白甲基化轉移酶、HDACs、聚ADP核糖聚合酶等。 

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