RFP/GFP安全港HEK293細胞系是一種穩(wěn)定的HEK293細胞系，持續(xù)表達RFP（紅色熒光蛋白）和CopGFP（Pontellina plumata綠色熒光蛋白），它們已穩(wěn)定整合到19號染色體上的AAVS1安全港位點。

RFP的表達由CMV啟動子驅動，而CopGFP由EF1A啟動子驅動。結合的DNA片段（CMV-RFP-bGH Poly A-EF1A-CopGFP-T2A-Puro-SV40 Poly A）（圖1）使用CRISPR/Cas9技術整合到AAVS1安全港位點。通過限制稀釋獲得單克隆群體。預計這種細胞系的行為將類似于親本HEK293細胞系。

圖1：在AAVS1位點的轉基因整合。

背景：

人類19號染色體上的AAVS1（也稱為PPP1R12C位點）是經(jīng)過充分驗證的“安全港”位點，用于承載DNA轉基因。AAVS1具有開放的染色質結構，并且具有轉錄能力。最重要的是，通過插入DNA轉基因破壞AAVS1位點對細胞沒有已知的不良影響。與使用其他方法（如慢病毒感染或細胞轉染）獲得的隨機整合相比，特別針對AAVS1位點是一個主要優(yōu)勢，這些方法可能會引起插入性突變或破壞重要基因或細胞過程。RFP（紅色熒光蛋白）是來自Dsred的紅橙色衍生物，最初從Discosoma中分離出來，而GFP（綠色熒光蛋白）呈現(xiàn)綠色熒光，最初在Aequorea Victoria中被發(fā)現(xiàn)。后來發(fā)現(xiàn)的Pontellina plumata GFP（CopGFP）是一種超亮且成熟速率快的熒光蛋白。熒光蛋白的存在允許通過流式細胞儀或熒光顯微鏡進行細胞識別和定量，以及體內定位研究，提供簡單的檢測讀數(shù)。

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應用：

- 作為基于細胞的檢測中的對照。

- 用于引入進一步感興趣的修改。

細胞培養(yǎng)協(xié)議：

注意：HEK293細胞源自人類材料，因此建議采取適當?shù)陌踩A防措施。

細胞解凍：

1. 從液氮存儲中取出一個細胞瓶。在準備好解凍之前，將其保存在干冰上。

2. 準備好解凍時，在37°C水浴中旋轉冷凍細胞瓶大約60秒。一旦細胞解凍（可能比60秒稍快或稍慢），迅速將瓶中的內容轉移到一個空的50毫升錐形管中。

注意：在37°C水浴中放置細胞太久會導致活性迅速喪失。

3. 使用10毫升的血清學移液管，慢慢地向含有細胞的錐形管中加入10毫升預熱的解凍培養(yǎng)基6。解凍培養(yǎng)基6應該滴加，同時輕輕搖晃錐形管，以實現(xiàn)溫和混合，避免滲透沖擊。

4. 立即以300 x g的速度離心細胞5分鐘，去除培養(yǎng)基，并將細胞在5毫升預熱的解凍培養(yǎng)基6中重懸。

5. 將重懸的細胞轉移到T25或T75培養(yǎng)瓶中，并在37°C、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

6. 培養(yǎng)24小時后，檢查細胞附著和活力。更換為新鮮的解凍培養(yǎng)基6，并在37°C、5% CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，直到細胞準備好傳代。

7. 細胞應在完全融合前傳代。

細胞傳代：

1. 抽吸培養(yǎng)基，用無Ca2+/Mg2+的磷酸鹽緩沖液（PBS）沖洗細胞，并用0.05% Trypsin/EDTA從培養(yǎng)容器中分離細胞。

2. 一旦細胞分離，加入解凍培養(yǎng)基6并轉移到管中。

3. 以300 x g的速度離心細胞5分鐘，去除培養(yǎng)基，并將細胞在解凍培養(yǎng)基6中重懸。

4. 按照推薦的次培養(yǎng)比例1:6至1:8每周或每周兩次，將細胞種植到新的培養(yǎng)容器中。

細胞冷凍：

1. 抽吸培養(yǎng)基，用無Ca2+/Mg2+的磷酸鹽緩沖液（PBS）沖洗細胞，并用0.05% Trypsin/EDTA從培養(yǎng)容器中分離細胞。

2. 一旦細胞分離，加入解凍培養(yǎng)基6并計數(shù)細胞。

3. 以300 x g的速度離心細胞5分鐘，去除培養(yǎng)基，并將細胞在4°C細胞冷凍培養(yǎng)基（BPS Bioscience #79796）中重懸，細胞濃度約為2 x 10^6細胞/ml。

4. 將1毫升的細胞懸浮液分裝到每個冷凍瓶中。將瓶子放入絕緣容器中緩慢冷卻，并在-80°C下過夜保存。

5. 次日將瓶子轉移到液氮中進行長期存儲。

注意：建議擴展細胞并在早期傳代時至少冷凍10瓶細胞以備將來使用。

圖2：通過PCR（聚合酶鏈反應）穩(wěn)定整合到AAVS1安全港位點。

在整合的5'端，跨越19號染色體AAVS1位點和CMV RFP整合開始的區(qū)域通過PCR擴增，預計大小為1.1 kb。在整合的3'端，跨越EF1α GFP-Puro整合和19號染色體AAVS1位點的區(qū)域通過PCR擴增，預計大小為1.2 kb。使用親本HEK293細胞作為對照。

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