腺苷A2A受體（A2aR或ADORA2A）在HEK293細(xì)胞中穩(wěn)定表達(dá)（NM_000675.5）。A2aR是七跨膜G蛋白偶聯(lián)受體（GPCR）家族的成員。A2aR的活動(dòng)通過Gαs蛋白介導(dǎo)，該蛋白激活腺苷酸環(huán)化酶，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)cAMP的合成。cAMP的水平與腺苷的水平相關(guān)。這個(gè)細(xì)胞系可以用來測(cè)量A2aR激動(dòng)劑或拮抗劑的EC50和IC50值。

腺苷信號(hào)在炎癥和免疫反應(yīng)中扮演著重要角色。腫瘤微環(huán)境中的許多細(xì)胞表達(dá)異位的CD39和CD73，導(dǎo)致細(xì)胞外腺苷的積累。腺苷與T細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、NK細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞表面的高親和力腺苷A2A受體（A2aR）結(jié)合，導(dǎo)致免疫反應(yīng)的下調(diào)。因此，A2aR是一種新型的免疫檢查點(diǎn)蛋白，A2aR的阻斷正在作為潛在的免疫療法被積極研究。幾種A2aR拮抗劑已經(jīng)進(jìn)入帕金森病治療的臨床試驗(yàn)，并且前臨床研究已經(jīng)證實(shí)阻斷A2aR激活能夠顯著增強(qiáng)抗腫瘤免疫。用A2aR拮抗劑（如ZM241385或咖啡因）處理的小鼠顯示出明顯的腫瘤生長(zhǎng)延遲，而A2aR敲除小鼠顯示出增加的腫瘤排斥。最有希望的是，A2aR阻斷可以與其他免疫檢查點(diǎn)途徑的抑制協(xié)同使用。研究表明，A2aR阻斷和PD-1抑制的聯(lián)合使用比單獨(dú)任一治療更有效，A2aR阻斷增加了CTLA-4和TIM-3抑制在控制CD73+黑色素瘤生長(zhǎng)中的活性。

作為BPS Bioscience在中國(guó)的區(qū)域總代理，艾美捷科技強(qiáng)烈推薦BPS Bioscience熱銷產(chǎn)品腺苷A2A受體功能HEK293細(xì)胞系。產(chǎn)品僅用于科研，不可用于臨床診斷。

應(yīng)用

? 篩選或滴定A2aR的激動(dòng)劑或拮抗劑。

? 研究PD-1和CTLA-4聯(lián)合療法。

細(xì)胞培養(yǎng)協(xié)議

細(xì)胞解凍

1. 在37°C水浴中搖晃冷凍細(xì)胞的小瓶大約60秒。細(xì)胞解凍后（可能比60秒稍快或稍慢），迅速將整個(gè)小瓶?jī)?nèi)容物轉(zhuǎn)移到含有10毫升預(yù)溫的解凍培養(yǎng)基1（不含潮霉素）的試管中。在37°C水浴中放置過久會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞活性迅速喪失。

2. 立即以300 x g的速度離心細(xì)胞5分鐘，去除培養(yǎng)基，并在5毫升預(yù)溫的解凍培養(yǎng)基1（不含潮霉素）中重懸細(xì)胞。

3. 將重懸的細(xì)胞轉(zhuǎn)移到T25或T75培養(yǎng)瓶中，并在37°C的5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

4. 培養(yǎng)24小時(shí)后，檢查細(xì)胞附著和活性。更換為新鮮的解凍培養(yǎng)基1（不含潮霉素），并在37°C的5% CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，直到細(xì)胞準(zhǔn)備好傳代。

5. 細(xì)胞應(yīng)在完全融合前傳代。在第一次傳代及后續(xù)傳代中，使用生長(zhǎng)培養(yǎng)基1G（含潮霉素）。

細(xì)胞傳代

1. 抽吸培養(yǎng)基，用磷酸鹽緩沖液（PBS）沖洗細(xì)胞，并用0.05%胰蛋白酶/EDTA從培養(yǎng)容器中分離細(xì)胞。

2. 一旦細(xì)胞分離，加入生長(zhǎng)培養(yǎng)基1G并轉(zhuǎn)移到試管中。以300 x g的速度離心細(xì)胞5分鐘，去除培養(yǎng)基，并在生長(zhǎng)培養(yǎng)基1G（含潮霉素）中重懸細(xì)胞。按照期望的次培養(yǎng)比例[每周1:6至1:8或每周兩次]接種到新的培養(yǎng)容器中。

細(xì)胞冷凍

1. 抽吸培養(yǎng)基，用磷酸鹽緩沖液（PBS）沖洗細(xì)胞，并用0.05%胰蛋白酶/EDTA從培養(yǎng)容器中分離細(xì)胞。

2. 一旦細(xì)胞分離，加入生長(zhǎng)培養(yǎng)基1G并計(jì)數(shù)細(xì)胞。

3. 以300 x g的速度離心細(xì)胞5分鐘，去除培養(yǎng)基，并在4°C的冷凍培養(yǎng)基（BPS Bioscience #79796，或10% DMSO + 90% FBS）中重懸細(xì)胞至約2 x 10^6細(xì)胞/毫升。

4. 將1毫升的細(xì)胞等分到冷凍小瓶中。將小瓶放置在保溫容器中緩慢冷卻，并在-80°C下過夜保存。

5. 次日將小瓶轉(zhuǎn)移到液氮中保存。

數(shù)據(jù)展示：

圖1：在HEK293細(xì)胞表面表達(dá)人類A2aR。

細(xì)胞與PE標(biāo)記的抗人A2aR抗體（R&D Systems #FAB94971P100）共同孵育，并通過流式細(xì)胞儀進(jìn)行分析。親本HEK293細(xì)胞用作陰性對(duì)照（紅色）。

檢測(cè)到一個(gè)A2aR陽(yáng)性的克隆群體（克隆B11）（藍(lán)色）。

文獻(xiàn)參考：

1. Leone RD, et al. (2015) Comp. Struct. Biotechnol. J. 13: 265-272

2. Ma S-R, et al. (2017) Molec. Cancer 16: 99

3. Ohta A, et al. (2016) Front. Immunol. 7: 109.

4. Yang et al, et al. (2017) Purinergic Signal. 13(2): 191–201

5. Mediavilla-Varela, et al. (2017) Neoplasia. 19(7) : 530–536 

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