ADAR1反應(yīng)型熒光素酶報告基因HEK293細(xì)胞系是一種設(shè)計用來響應(yīng)ADAR1酶活性的HEK293細(xì)胞系。這些細(xì)胞被改造以表達(dá)一個ADAR1報告基因構(gòu)建體，包含一個ADAR1發(fā)夾靶標(biāo)，其帶有可被ADAR1介導(dǎo)編輯成色氨酸（UUG）的終止密碼子（UAG），位于熒光素酶報告基因的上游（圖1）。

該細(xì)胞系已通過比較轉(zhuǎn)染ADAR1和ADAR2后的報告基因激活情況進(jìn)行了驗證。這個細(xì)胞系已被用于開發(fā)恒定表達(dá)ADAR1的ADAR1活性熒光素酶報告基因HEK293細(xì)胞系（#82239）。

圖1：ADAR1反應(yīng)型熒光素酶報告基因HEK293細(xì)胞系的作用機(jī)制圖示。

ADAR1報告基因構(gòu)建體由一個帶有終止密碼子（UAG）的ADAR1發(fā)夾靶標(biāo)組成，位于編碼熒光素酶的序列上游。在ADAR1活性存在的情況下，例如轉(zhuǎn)染ADAR1時，腺嘌呤被轉(zhuǎn)換成肌苷，現(xiàn)在編碼氨基酸色氨酸（UUG），使得熒光素酶的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)成為可能。在沒有轉(zhuǎn)染ADAR1的情況下，熒光素酶不會被轉(zhuǎn)錄，細(xì)胞顯示背景熒光素酶活性。熒光素酶活性與ADAR1活性直接相關(guān)。

背景

ADAR（作用于RNA的腺苷脫氨酶）酶在RNA中執(zhí)行腺苷到肌苷的堿基編輯，特別針對位于特定雙鏈莖環(huán)結(jié)構(gòu)（圖1）中的腺苷。在健康的未感染細(xì)胞中，ADAR1對內(nèi)源性雙鏈RNA進(jìn)行A到I編輯，以防止其激活下游的dsRNA傳感器RIG-I（視黃酸誘導(dǎo)基因I）和MDA5（黑色素瘤分化相關(guān)蛋白5），進(jìn)而激活促炎癥反應(yīng)。ADAR1功能喪失突變導(dǎo)致dsRNA傳感器異常激活，并涉及自身免疫性疾病。ADAR1功能障礙也影響癌細(xì)胞生長、增殖和對免疫療法的反應(yīng)。ADAR1在許多腫瘤類型中表達(dá)增加，ADAR1敲除已被證明可以改善對某些免疫療法的反應(yīng)，如PD-1（程序性死亡蛋白1）/PD-L1（程序性死亡配體1）阻斷，并可繞過腫瘤免疫療法抵抗機(jī)制，使ADAR1成為治療開發(fā)的理想靶標(biāo)。

HEK293細(xì)胞內(nèi)源性ADAR1表達(dá)水平低，因此這個細(xì)胞系非常適合研究ADAR1的遺傳工程變體。例如，可以通過轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)導(dǎo)將ADAR1變體引入細(xì)胞并比較其活性。使用熒光素酶作為報告基因允許簡單的檢測讀出，使這個細(xì)胞系成為ADAR1研究的有吸引力的細(xì)胞系統(tǒng)。

作為BPS Bioscience在中國的區(qū)域總代理，艾美捷科技強烈推薦BPS Bioscience熱銷產(chǎn)品ADAR1 響應(yīng)型熒光素酶報告基因 HEK293 細(xì)胞系。產(chǎn)品僅用于科研，不可用于臨床診斷。

應(yīng)用

? 監(jiān)測表達(dá)的ADAR1活性。

? 在細(xì)胞模型中比較ADAR1修飾和突變的活性，例如在研究ADAR1衍生物結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系以及RNA編輯療法的研究中。

細(xì)胞復(fù)蘇

1. 在37°C水浴中旋轉(zhuǎn)冷凍細(xì)胞瓶大約60秒。細(xì)胞解凍后（可能比60秒稍快或稍慢），迅速將瓶內(nèi)的全部內(nèi)容轉(zhuǎn)移到含有10毫升預(yù)熱的解凍培養(yǎng)基1的管中。

注意：在37°C水浴中放置細(xì)胞過久會導(dǎo)致細(xì)胞活力迅速下降。

2. 立即以300 x g的速度離心細(xì)胞5分鐘，去除培養(yǎng)基，并在5毫升預(yù)熱的解凍培養(yǎng)基1中重懸細(xì)胞。

3. 將重懸的細(xì)胞轉(zhuǎn)移到T25或T75培養(yǎng)瓶中，并在37°C、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

4. 培養(yǎng)24小時后，檢查細(xì)胞附著和活力。更換為新鮮的解凍培養(yǎng)基1，并繼續(xù)在37°C、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，直到細(xì)胞準(zhǔn)備好傳代。

5. 在細(xì)胞完全融合之前應(yīng)進(jìn)行傳代。在第一次傳代及后續(xù)傳代中，使用生長培養(yǎng)基1N。

細(xì)胞傳代

1. 吸去培養(yǎng)基，用不含Ca2+/Mg2+的磷酸鹽緩沖液（PBS）洗滌細(xì)胞，并用0.05%胰蛋白酶/EDTA從培養(yǎng)容器中分離細(xì)胞。

2. 一旦細(xì)胞分離，加入生長培養(yǎng)基1N并轉(zhuǎn)移到管中。

3. 以300 x g的速度離心細(xì)胞5分鐘，去除培養(yǎng)基，并在生長培養(yǎng)基1N中重懸細(xì)胞。

4. 按推薦的亞培養(yǎng)比例1:5至1:10每周一次或兩次播種到新的培養(yǎng)容器中。

細(xì)胞冷凍

1. 吸去培養(yǎng)基，用不含Ca2+/Mg2+的PBS洗滌細(xì)胞，并用0.05%胰蛋白酶/EDTA從培養(yǎng)容器中分離細(xì)胞。

2. 一旦細(xì)胞分離，加入生長培養(yǎng)基1N并計數(shù)細(xì)胞。

3. 以300 x g的速度離心細(xì)胞5分鐘，去除培養(yǎng)基，并在4°C細(xì)胞冷凍培養(yǎng)基（BPS Bioscience #79796）中重懸細(xì)胞，濃度約為1 x 10^6細(xì)胞/毫升。

4. 將1毫升細(xì)胞懸浮液分裝到每個冷凍管中。將管放入絕緣容器中緩慢冷卻，并在-80°C下過夜儲存。

5. 次日將管轉(zhuǎn)移到液氮中進(jìn)行長期儲存。

注意：建議在早期傳代擴(kuò)展細(xì)胞并至少冷凍10管細(xì)胞以備將來使用。

驗證數(shù)據(jù)

? 以下實驗設(shè)計為96孔板格式。在不同的組織培養(yǎng)格式中進(jìn)行實驗時，應(yīng)適當(dāng)調(diào)整細(xì)胞數(shù)量和試劑體積。

? 所有條件應(yīng)在三個副本中進(jìn)行。

? 實驗應(yīng)包括“ADAR過表達(dá)”（通過轉(zhuǎn)染或其他方法引入ADAR1或ADAR2的細(xì)胞），“陰性對照”（未添加ADAR1或ADAR2，模擬轉(zhuǎn)染條件）和“背景發(fā)光”條件。

圖2：轉(zhuǎn)染不同ADAR1亞型的ADAR1反應(yīng)型熒光素酶報告基因HEK293細(xì)胞系中ADAR1報告基因的反應(yīng)。

細(xì)胞轉(zhuǎn)染編碼不同ADAR1亞型（ADAR1 p150和ADAR1 p110）或ADAR2的質(zhì)粒24小時。使用One-Step?熒光素酶檢測系統(tǒng)測量熒光素酶活性。結(jié)果表示為ADAR1熒光素酶報告基因活性的倍數(shù)誘導(dǎo)（與未過表達(dá)ADAR的細(xì)胞相比）。

BPS Bioscience是一家通過ISO 9001:2015認(rèn)證的生命科學(xué)領(lǐng)域的供應(yīng)商，公司一直致力于開發(fā)藥物研發(fā)領(lǐng)域的重組蛋白酶、蛋白酶活性/抑制劑篩選試劑盒和慢病毒等工具。公司由Henry Zhu博士于2005年創(chuàng)立，從創(chuàng)立至今一直致力于提供藥物研發(fā)領(lǐng)域的創(chuàng)新解決方案，以推動新的藥物發(fā)現(xiàn)。公司主要關(guān)注的領(lǐng)域包括免疫療法、表觀遺傳學(xué)、新型冠狀病毒、CRISPR、細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等，主要提供激酶、磷酸二酯酶、磷酸酶、組蛋白去甲基化酶、組蛋白甲基化轉(zhuǎn)移酶、HDACs、聚ADP核糖聚合酶等。 

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