研究目的：

Wieslab 補(bǔ)體系統(tǒng)MBL途徑試劑盒是一種酶免疫測(cè)定法，用于定性測(cè)定人血清中MBL補(bǔ)體途徑，其結(jié)果不得用于臨床診斷或患者管理。

概述和解釋

補(bǔ)體系統(tǒng)在慢性、自身免疫和感染性疾病中發(fā)揮著重要作用。補(bǔ)體激活有三個(gè)途徑（圖1），即經(jīng)典途徑、替代途徑和凝集素途徑。

補(bǔ)體活性受損會(huì)導(dǎo)致人類易患重復(fù)性暴發(fā)性或嚴(yán)重感染，并可能促進(jìn)自身免疫疾病的發(fā)展。補(bǔ)體的不適當(dāng)激活會(huì)導(dǎo)致慢性炎癥和組織損傷。

體外補(bǔ)體序列的激活導(dǎo)致補(bǔ)體成分的消耗，這反過(guò)來(lái)導(dǎo)致它們濃度的降低。因此，補(bǔ)體蛋白或補(bǔ)體活性的測(cè)定用于指示補(bǔ)體系統(tǒng)是否已被免疫和/或病理機(jī)制激活。當(dāng)懷疑補(bǔ)體激活性疾病或可能存在遺傳性缺陷時(shí)，功能性和免疫化學(xué)補(bǔ)體測(cè)量都用于評(píng)估個(gè)體。通過(guò)功能性測(cè)定（如Wieslab?補(bǔ)體試劑盒）評(píng)估的補(bǔ)體活性水平考慮了成分的合成、降解和消耗速率，并提供了途徑完整性的度量，與免疫化學(xué)方法相對(duì)，后者專門測(cè)量各種補(bǔ)體成分的濃度。

艾美捷補(bǔ)體凝集素/MBL途徑檢測(cè)試劑盒（WIESLAB Complement System MBL Pathway）（#COMPLMP320）的測(cè)定原理：

Wieslab 補(bǔ)體測(cè)定結(jié)合了補(bǔ)體激活的溶血測(cè)定原理和使用特定于補(bǔ)體激活產(chǎn)生的新抗原的標(biāo)記抗體。產(chǎn)生的新抗原量與補(bǔ)體途徑的功能活性成正比。

在補(bǔ)體系統(tǒng)MP試劑盒中，微孔板條的孔被MBL途徑的特定激活劑包被。受試者血清在含有特定阻斷劑的稀釋液中稀釋，以確保只有MBL途徑被激活。在孔中孵育稀釋的受試者血清期間，補(bǔ)體通過(guò)特定包被被激活。

然后洗滌孔，并使用特定的堿性磷酸酶標(biāo)記抗體檢測(cè)在MAC（膜攻擊復(fù)合物）形成期間表達(dá)的新抗原上的C5b-9。

在進(jìn)一步洗滌步驟后，通過(guò)與堿性磷酸酶底物溶液孵育獲得特定抗體的檢測(cè)。補(bǔ)體激活量與顏色強(qiáng)度相關(guān)，并以吸光度（光密度（OD））來(lái)衡量。

警告和注意事項(xiàng)：

僅供研究使用。不用于診斷程序。

試劑盒中用于制備對(duì)照品的人血清成分已經(jīng)過(guò)FDA批準(zhǔn)的方法檢測(cè)人類免疫缺陷病毒1型和2型（HIV 1&2）、丙型肝炎（HCV）以及乙型肝炎表面抗原，結(jié)果均為陰性。因?yàn)闆]有測(cè)試方法可以完全保證HIV、HCV、乙型肝炎病毒或其他傳染性因子的缺失，所以樣本和基于人類的試劑應(yīng)被視為可能傳播傳染性因子進(jìn)行處理。

疾病控制和預(yù)防中心以及國(guó)家衛(wèi)生研究院建議在生物安全等級(jí)2下處理潛在的傳染性因子。

樣本收集：

血液樣本應(yīng)使用無(wú)菌靜脈穿刺技術(shù)收集，并使用標(biāo)準(zhǔn)程序獲得血清。建議至少收集5毫升全血。讓血液在血清管中在室溫（20-25°C）下凝固60-65分鐘。離心血液樣本，并將無(wú)細(xì)胞血清轉(zhuǎn)移到干凈的管中。血清必須正確處理以防止體外補(bǔ)體激活。

血清應(yīng)密封在緊緊封閉的管中冷凍在-70°C或更低的溫度下，以便于長(zhǎng)期儲(chǔ)存或在干冰上運(yùn)輸。樣本不應(yīng)多次冷凍和解凍。

避免使用黃疸、乳糜和溶血的血清。

不能使用熱滅活血清。不能使用血漿。

NCCLS提供了儲(chǔ)存血液樣本的建議（血液樣本處理和處理程序的批準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)，H18A，1990年）。

試劑盒組件和試劑儲(chǔ)存

一個(gè)框架，帶有無(wú)色分離孔（12x8），密封在帶有干燥劑的鋁箔包裝中。孔已用甘露糖包被。

35毫升MP稀釋液（Dil MP），標(biāo)為綠色。

13毫升含有堿性磷酸酶標(biāo)記的C5b-9抗體的結(jié)合物（藍(lán)色）。

13毫升即用型底物溶液。

30毫升30倍濃縮的洗滌溶液。

0.2毫升陰性對(duì)照（NC），含有人血清（應(yīng)按受試者血清樣本稀釋）。

0.2毫升陽(yáng)性對(duì)照（PC），含有凍干人血清，見下文“陽(yáng)性對(duì)照的重組”。

試劑盒中的所有試劑都已準(zhǔn)備好使用，除了洗滌溶液和對(duì)照品。試劑應(yīng)儲(chǔ)存在2-8°C，除了陽(yáng)性對(duì)照。

陽(yáng)性對(duì)照應(yīng)儲(chǔ)存在-20°C。

所需但未提供的物料或設(shè)備：

帶有405納米濾光片的微孔板讀取器。

帶有一次性吸頭的精密移液器。

用于條帶的清洗器、吸水紙、管子和一個(gè)計(jì)時(shí)器。

結(jié)果計(jì)算：

從NC、PC和樣本中減去空白（稀釋液）的吸光度。陽(yáng)性對(duì)照的吸光度應(yīng)大于1，陰性對(duì)照的吸光度應(yīng)小于0.2。

陰性和陽(yáng)性對(duì)照可以以半定量的方式用來(lái)計(jì)算補(bǔ)體活性。

計(jì)算樣本、PC和NC的平均OD405nm值，并按以下方式計(jì)算%補(bǔ)體活性：(樣本-NC)/(PC-NC)x100。陰性和陽(yáng)性對(duì)照旨在監(jiān)測(cè)試劑的顯著失敗。陽(yáng)性對(duì)照不能確保在測(cè)定截止值處的精確度。建議每個(gè)實(shí)驗(yàn)室建立自己的參考水平和缺陷的截止值。

陰性結(jié)果，即缺陷，應(yīng)始終通過(guò)測(cè)試新樣本來(lái)驗(yàn)證，以確保沒有發(fā)生體外補(bǔ)體激活。

受試者結(jié)果：

體外補(bǔ)體序列的激活導(dǎo)致補(bǔ)體成分的消耗，這反過(guò)來(lái)導(dǎo)致它們濃度的降低。因此，補(bǔ)體蛋白或補(bǔ)體活性的測(cè)定用于指示補(bǔ)體系統(tǒng)是否已被免疫和/或病理機(jī)制激活。當(dāng)懷疑補(bǔ)體激活性疾病或可能存在遺傳性缺陷時(shí)，功能性和免疫化學(xué)補(bǔ)體測(cè)量都用于評(píng)估患者。通過(guò)功能性測(cè)定（如Wieslab 補(bǔ)體試劑盒）評(píng)估的補(bǔ)體活性水平考慮了成分的合成、降解和消耗速率，并提供了途徑完整性的度量，與免疫化學(xué)方法相對(duì)，后者專門測(cè)量各種補(bǔ)體成分的濃度。當(dāng)發(fā)現(xiàn)補(bǔ)體成分或補(bǔ)體功能水平降低時(shí)，臨床醫(yī)生會(huì)考慮缺陷或正在進(jìn)行的免疫過(guò)程，導(dǎo)致成分分解增加和補(bǔ)體水平降低。補(bǔ)體水平的增加通常是急性期反應(yīng)的非特異性表現(xiàn)。

Wieslab 補(bǔ)體系統(tǒng)MBL途徑可以幫助檢測(cè)與MBL途徑相關(guān)的補(bǔ)體缺陷，如下表所示：使用Wieslab 補(bǔ)體系統(tǒng)篩選，可以更完整和深入地功能性評(píng)估所有三個(gè)補(bǔ)體途徑。

補(bǔ)體凝集素/MBL途徑檢測(cè)試劑盒文獻(xiàn)參考：

Walport M, Complement (First of two parts) N Engl J Med 2001, 344, 1058-1066.

Walport M, Complement (Second of two parts) N Engl J Med 2001, 344, 1140-1144.

Roos A, Bouwman L, Munoz J et al. , Functional characterization of the lectin pathway of complement in

human serum. Mol Immunol 2003, 39, 655-668.

Nordin Frediksson G, Truedsson L, Sj?holm A. New procedure for detection of complement deficiency

by ELISA. J Imm Meth 1993, 166, 263-270.

M.A. Seelen et al, Functional analysis of the classical, alternative and MBL pathways of the complement

system: standardization and validation of a simple ELISA. J Imm Meth 2005, 296, 187-198.