隨著X射線晶體學(xué)在結(jié)構(gòu)生物學(xué)中的重要性日益增加，高分辨率蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)解析成為了理解蛋白質(zhì)功能、配體結(jié)合及動(dòng)態(tài)變化的關(guān)鍵手段。然而，獲取高質(zhì)量衍射晶體仍然是一個(gè)挑戰(zhàn)，特別是當(dāng)需要避免傳統(tǒng)冷凍方法對晶體結(jié)構(gòu)可能產(chǎn)生的負(fù)面影響時(shí)。冷凍法雖然提高了晶體的穩(wěn)定性和衍射數(shù)據(jù)的質(zhì)量，但也可能凍結(jié)了某些功能相關(guān)的氨基酸構(gòu)象，從而限制了對蛋白質(zhì)在生理?xiàng)l件下動(dòng)態(tài)結(jié)構(gòu)的理解。

近年來，非冷凍條件下的室溫晶體學(xué)研究（Room Temperature Crystallography, RTC）逐漸受到重視。RTC不僅有助于捕捉更接近生理?xiàng)l件下的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，還能避免冷凍帶來的潛在問題，如晶體脫水、輻射損傷等。本文（Crystallization and In Situ Room Temperature Data Collection Using the Crystallization Facility at Harwell and Beamline VMXi, Diamond Light Source）介紹了一種基于Harwell的結(jié)晶設(shè)施和Diamond Light Source的VMXi光束線的室溫結(jié)晶及原位數(shù)據(jù)收集方法，提供了一種高效且自動(dòng)化程度高的結(jié)構(gòu)解析途徑。

實(shí)驗(yàn)流程

1. 樣品準(zhǔn)備與提交：研究者準(zhǔn)備高度純化的蛋白質(zhì)樣品，可選擇親自攜帶樣品到Harwell或郵寄樣品給工作人員代為設(shè)置結(jié)晶實(shí)驗(yàn)。

2. 結(jié)晶實(shí)驗(yàn)：在Harwell結(jié)晶設(shè)施中，使用納米升結(jié)晶機(jī)器人進(jìn)行結(jié)晶篩選和優(yōu)化。根據(jù)研究者需求，設(shè)置合適的結(jié)晶條件（如蛋白質(zhì)濃度、溫度、濕度等），并將結(jié)晶板放置在自動(dòng)化成像儀器中監(jiān)測晶體生長情況。

3. 數(shù)據(jù)收集：一旦晶體生長完成，結(jié)晶板被送至Diamond Light Source的VMXi光束線進(jìn)行數(shù)據(jù)收集。光束線通過機(jī)器人臂自動(dòng)加載結(jié)晶板，并使用機(jī)器學(xué)習(xí)算法自動(dòng)識別晶體位置。研究者通過ISPyB界面選擇晶體并定義數(shù)據(jù)收集參數(shù)，光束線則自動(dòng)收集高達(dá)60°旋轉(zhuǎn)的數(shù)據(jù)集。

4. 數(shù)據(jù)處理：收集的數(shù)據(jù)通過自動(dòng)處理管道（如xia2.multiplex）進(jìn)行合并和解析，生成高質(zhì)量的結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)。研究者可通過ISPyB界面訪問處理結(jié)果，并根據(jù)需要進(jìn)一步手動(dòng)處理數(shù)據(jù)。

晶體板中的序列晶體學(xué)：

(A) 結(jié)晶滴的光學(xué)圖像，白色框表示感興趣區(qū)域。

(B) 定義網(wǎng)格掃描點(diǎn)。

(C) 顯示衍射的熱圖。

(D) 來自超過9000個(gè)靜態(tài)衍射圖案的序列晶體學(xué)數(shù)據(jù)集產(chǎn)生的電子密度圖。

MiTeGen品牌的In Situ結(jié)晶板（cat#InSitu-01CL-40）在實(shí)驗(yàn)中發(fā)揮了關(guān)鍵作用。這些結(jié)晶板專為VMXi光束線設(shè)計(jì)，允許直接在結(jié)晶環(huán)境中測量晶體衍射數(shù)據(jù)，無需將晶體從原始環(huán)境中取出。這不僅避免了晶體在處理過程中可能受到的損傷，還提高了數(shù)據(jù)收集的效率和質(zhì)量。In Situ-1型96孔板具有以下優(yōu)點(diǎn)：

兼容性強(qiáng)：與VMXi光束線的設(shè)計(jì)完美匹配，確保數(shù)據(jù)收集的準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性。

高通量：支持同時(shí)處理多個(gè)樣品，提高實(shí)驗(yàn)效率。

減少干擾：允許在晶體生長的原始環(huán)境中進(jìn)行數(shù)據(jù)收集，減少了晶體處理過程中可能引入的干擾因素。

易于操作：板的設(shè)計(jì)和友好的界面使得實(shí)驗(yàn)設(shè)置和數(shù)據(jù)收集過程變得簡單快捷。

本文介紹了一種結(jié)合Harwell結(jié)晶設(shè)施和Diamond Light Source VMXi光束線的高效室溫晶體學(xué)研究方法。該方法通過原位結(jié)晶和數(shù)據(jù)收集技術(shù)，避免了傳統(tǒng)冷凍方法帶來的問題，并提高了數(shù)據(jù)的質(zhì)量和可靠性。MiTeGen品牌的InSitu系列結(jié)晶板作為實(shí)驗(yàn)中的重要工具，通過其設(shè)計(jì)上的優(yōu)化和兼容性，為室溫晶體學(xué)研究提供了有力支持。通過該方法，研究人員能夠快速獲得高質(zhì)量的室溫晶體結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)，進(jìn)而深入理解蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)、功能和動(dòng)態(tài)變化。此外，該方法還具有廣泛的適用性，可用于多種類型的蛋白質(zhì)和配體研究，為結(jié)構(gòu)生物學(xué)和藥物發(fā)現(xiàn)領(lǐng)域提供了有力工具。

未來，隨著技術(shù)的不斷進(jìn)步和應(yīng)用領(lǐng)域的不斷拓展，室溫晶體學(xué)研究有望在更多領(lǐng)域發(fā)揮重要作用，推動(dòng)科學(xué)研究的深入發(fā)展。