背景知識(shí)

泛素及其連接機(jī)制

泛素是一種小分子多肽，能夠通過其C末端與目標(biāo)蛋白上的賴氨酸殘基的氨基發(fā)生共價(jià)結(jié)合，這一過程被稱為單泛素化。此外，還可以通過泛素分子上存在的七個(gè)賴氨酸殘基中的任何一個(gè)，將更多的泛素分子連接到初始泛素上，形成泛素鏈，這一過程被稱為多泛素化。其中，通過泛素分子上第48位賴氨酸（K48）形成的泛素鏈?zhǔn)亲顬槿藗兯熘摹畏核鼗驯蛔C明可以改變目標(biāo)蛋白的定位、活性和/或功能。而多泛素化最常見的結(jié)果是通過蛋白酶體介導(dǎo)的目標(biāo)蛋白降解。

泛素與目標(biāo)蛋白的結(jié)合需要三種不同酶的協(xié)同作用，即E1（泛素激活酶）、E2（泛素結(jié)合酶）和E3（泛素連接酶），最終在泛素的C末端與目標(biāo)蛋白上的賴氨酸殘基的ε-氨基之間形成異肽鍵。泛素E3連接酶作為支架蛋白，為泛素結(jié)合酶（E2）和目標(biāo)底物提供結(jié)合位點(diǎn)。通常情況下，E3連接酶介導(dǎo)泛素從E2硫酯中間體轉(zhuǎn)移到目標(biāo)蛋白的酰胺鍵上。除了對(duì)底物進(jìn)行泛素化外，E3連接酶還可以自身泛素化。艾美捷作為LifeSensors的獨(dú)家代理商，將詳細(xì)介紹：

分子膠（Molecular Glue）

分子膠（蛋白質(zhì)降解靶向嵌合分子）通過人為地劫持泛素蛋白酶體系統(tǒng)（UPS）的組分來降解目標(biāo)蛋白。分子膠藥物是單價(jià)小分子，能夠與E3連接酶結(jié)合，使其能夠泛素化一個(gè)新的底物或目標(biāo)蛋白。理論上，將這兩個(gè)實(shí)體拉近會(huì)導(dǎo)致目標(biāo)蛋白的多泛素化和蛋白酶體降解。然而，鑒于這種情況的復(fù)雜性，并不總是如預(yù)期那樣發(fā)生，分子膠的發(fā)現(xiàn)策略面臨著許多挑戰(zhàn)和陷阱。目前的實(shí)驗(yàn)方法解決了許多這些挑戰(zhàn)，并作為一種工具，通過監(jiān)測(cè)分子膠介導(dǎo)的泛素化來有效報(bào)告真正的分子膠效率。

適用范圍

體外泛素化試劑盒旨在建立一種高通量方法，通過監(jiān)測(cè)目標(biāo)蛋白的內(nèi)在泛素化能力，準(zhǔn)確預(yù)測(cè)分子膠的效率。我們提供針對(duì)三種E3泛素連接酶（Cereblon、VHL和HDM2）的試劑盒，用于監(jiān)測(cè)分子膠介導(dǎo)的泛素化，以選擇目標(biāo)蛋白。

實(shí)驗(yàn)原理

使用預(yù)先涂有專有TUBE試劑的微量滴定板條（實(shí)驗(yàn)板）來捕獲分子膠依賴反應(yīng)中形成的多泛素鏈。在實(shí)驗(yàn)中，分子膠與E3連接酶和目標(biāo)蛋白（未包含）一起孵育，以促進(jìn)三元復(fù)合物的形成。接下來，加入含有泛素和ATP的E1-E2酶混合物以啟動(dòng)分子膠介導(dǎo)的泛素化。由E1-E2-E3-分子膠-目標(biāo)蛋白機(jī)制產(chǎn)生的多泛素鏈被捕獲在孔中，經(jīng)過洗滌后，使用針對(duì)目標(biāo)蛋白（未包含）的抗體和與HRP（包含）結(jié)合的二抗通過化學(xué)發(fā)光進(jìn)行檢測(cè)。因此，這種類似“三明治”ELISA的實(shí)驗(yàn)中產(chǎn)生的信號(hào)是分子膠活性的定量測(cè)量。

LifeSensors 分子膠體外泛素化實(shí)驗(yàn)試劑盒優(yōu)勢(shì)：

1. 在高通量篩選（HTS）格式下，通過監(jiān)測(cè)泛素化來監(jiān)測(cè)分子膠活性，選擇您感興趣的目標(biāo)蛋白。

2. 同時(shí)篩選多種分子膠變體。

3. 準(zhǔn)確建立排序效力，指導(dǎo)藥物化學(xué)家進(jìn)行可靠的結(jié)構(gòu)活性關(guān)系（SAR）研究。

4. 通過合理設(shè)計(jì)依賴于功能性實(shí)驗(yàn)的分子膠，這些實(shí)驗(yàn)報(bào)告蛋白質(zhì)的“泛素化潛力”，加速分子膠藥物的發(fā)現(xiàn)和臨床開發(fā)。

5. 該檢測(cè)策略不需要對(duì)泛素進(jìn)行非天然標(biāo)記或標(biāo)記，這可能導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)偽影。

建議用途

1. 測(cè)試和比較多種分子膠的活性，并建立與DC50的相關(guān)性。

2. 比較分子膠與CRBN或其他E3連接酶的活性。

3. 測(cè)試分子膠目標(biāo)蛋白的特異性和亞型選擇性。

試劑盒組成

1. 體外泛素化實(shí)驗(yàn)板

- 注意：不要將實(shí)驗(yàn)板快速解凍至室溫。建議將實(shí)驗(yàn)板在4°C下放置30分鐘，然后再轉(zhuǎn)移到室溫。

2. 實(shí)驗(yàn)緩沖液（10倍）–1 x 1.2 mL

- 重要提示：在1倍實(shí)驗(yàn)緩沖液中加入β-巰基乙醇，使其最終濃度達(dá)到1 mM。

3. E3混合液（20倍）–1 x 250 uL

4. E1-E2-泛素混合液（20倍）–1 x 250 uL

5. 二抗（抗小鼠或抗兔HRP結(jié)合物，100倍）–1 x 60uL

6. 檢測(cè)試劑DR1和DR2（2倍）–1 x 1 mL過氧化氫和1 x 1 mL魯米諾

7. 封閉濃縮液（5倍）–1 x 5 mL

8. 陽性對(duì)照試劑：

- 生物素-多泛素鏈（20倍）：1 x 25 uL

- 鏈霉親和素HRP（100倍）：1 x 10 uL

儲(chǔ)存和穩(wěn)定性

將所有材料儲(chǔ)存于-80?C。避免多次凍融循環(huán)。如果在適當(dāng)?shù)臏囟认聝?chǔ)存，所有組分至少穩(wěn)定6個(gè)月。

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