Flipper TR是一種熒光探針，專門針對細(xì)胞質(zhì)膜，并通過其熒光壽命變化報(bào)告膜張力變化。它是Flipper探針家族中最先進(jìn)的成員，2，3），通過機(jī)械載體的兩個(gè)扭曲的二噻吩噻吩之間的扭曲角和極化的變化來感知脂質(zhì)雙層膜組織的變化。Flipper TR會(huì)自發(fā)地插入細(xì)胞的質(zhì)膜中，當(dāng)插入脂質(zhì)膜時(shí)，它只會(huì)發(fā)出熒光。它具有廣泛的吸收和發(fā)射光譜，通常可以用488nm激光激發(fā)，而發(fā)射在575和625nm之間。Flipper TR可用于多種生物，包括細(xì)菌、酵母、哺乳動(dòng)物和植物。

作為Cytoskeleton全國總代理，艾美捷科技強(qiáng)烈推薦Cytoskeleton熱銷產(chǎn)品熒光細(xì)胞膜顯微鏡的鰭狀肢-TR 試劑盒。產(chǎn)品僅用于科研，不可用于臨床診斷。   

Cytoskeleton公司目前主要的產(chǎn)品有340余種，其產(chǎn)品主要覆蓋肌動(dòng)蛋白，微管蛋白，馬達(dá)蛋白，小G蛋白，細(xì)胞外基質(zhì)，活細(xì)胞成像等相關(guān)領(lǐng)域，提供對應(yīng)的蛋白質(zhì)，抗體，檢測與分析試劑盒，并且產(chǎn)品線還在不斷的擴(kuò)大中。

儲(chǔ)存： 

收到探頭后，將其儲(chǔ)存在-20°C。使用新的無水DMSO制備探針溶液（因?yàn)榕f的和濕的DMSO會(huì)大大縮短探針的保質(zhì)期）。使用后將探頭溶液儲(chǔ)存在-20°C。打開小瓶前，應(yīng)將其加熱至室溫。妥善儲(chǔ)存后，溶液中的探針應(yīng)穩(wěn)定3個(gè)月。注意：處理DMSO溶液時(shí)應(yīng)特別小心，因?yàn)镈MSO有助于有機(jī)分子進(jìn)入組織。按照所有相關(guān)的當(dāng)?shù)胤ㄒ?guī)處理這些試劑。 

注：該方案使用粘附在蓋玻片上的HeLa細(xì)胞進(jìn)行了優(yōu)化，并已在其他常見細(xì)胞系中得到證實(shí)。應(yīng)將實(shí)驗(yàn)方案的建議作為起點(diǎn)，并根據(jù)經(jīng)驗(yàn)確定每種細(xì)胞類型的最佳標(biāo)記條件。  

制備1mM儲(chǔ)備溶液 

將Flipper TR小瓶的內(nèi)容物溶解在50μL無水DMSO中，制成1mM儲(chǔ)備溶液。該溶液應(yīng)儲(chǔ)存在-20°C或更低的溫度下。不要將溶液分成小份，它們會(huì)更快地腐爛，并且化合物不會(huì)被多次凍融循環(huán)改變。如果儲(chǔ)存得當(dāng)，該儲(chǔ)備溶液應(yīng)穩(wěn)定三個(gè)月。（可選）如果需要準(zhǔn)確測定儲(chǔ)備溶液的濃度，稀釋1?l 1mM儲(chǔ)備溶液，99?l二甲基亞砜。在425 nm處測量吸光度。使用上述消光系數(shù)計(jì)算濃度。   

準(zhǔn)備染色溶液 

將Flipper TR稀釋至所需濃度（從1開始?M） 在應(yīng)用于細(xì)胞之前不久在細(xì)胞培養(yǎng)基中（使用前不要將染色溶液保持超過2小時(shí)）。注：當(dāng)使用含有胎牛血清（FCS）或其他血清的細(xì)胞培養(yǎng)基時(shí)，與沒有血清的培養(yǎng)基相比，標(biāo)記效率可能會(huì)降低。像往常一樣，在蓋玻片、玻璃底皿或玻璃底多孔板上培養(yǎng)細(xì)胞。當(dāng)細(xì)胞達(dá)到所需密度時(shí)，用染色溶液替換培養(yǎng)基，確保所有細(xì)胞都被溶液覆蓋。成像前，將細(xì)胞置于37°C、含5%CO2的濕潤環(huán)境中的培養(yǎng)箱中15分鐘。30分鐘或更長時(shí)間后，由于膜翻轉(zhuǎn)，可以看到內(nèi)體結(jié)構(gòu)的標(biāo)記。   

然而，含有細(xì)胞器（內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體）的細(xì)胞是有限的。內(nèi)體結(jié)構(gòu)通常具有較低的壽命。任選地，可以去除含有探針的培養(yǎng)基，并在新鮮培養(yǎng)基中洗滌細(xì)胞一次。由于探針僅在膜中是熒光的，因此不需要移除探針，特別是在計(jì)劃長期成像（>24h）時(shí)培養(yǎng)基含有血清的情況下。   

使用485或488nm脈沖激光通過600/50nm帶通濾波器激發(fā)和收集光子，用標(biāo)準(zhǔn)FLIM顯微鏡對細(xì)胞成像。我們建議優(yōu)化標(biāo)記程序以及圖像采集設(shè)置，以最小化488nm激發(fā)光在活體樣品上引起的光損傷。為了提取壽命信息，將ROI或單個(gè)像素的光子直方圖（累積足夠的計(jì)數(shù)以確保良好的統(tǒng)計(jì)）與雙指數(shù)和兩個(gè)衰減時(shí)間進(jìn)行擬合，?1和?2被提取。具有更高擬合振幅的最長壽命?1用于報(bào)告膜張力，在2.8和7.0納秒之間變化。更長的壽命意味著膜中的張力更大。?2具有較小的值（在0.5和2ns之間）和較小的擬合振幅不太適合研究膜張力。使用參考文獻(xiàn)1中給出的校準(zhǔn)程序，可以將壽命與絕對膜張力相關(guān)。 

使用熒光細(xì)胞膜顯微鏡的鰭狀肢-TR 試劑盒重要注意事項(xiàng)：

-膜張力測量只能通過FLIM顯微鏡進(jìn)行，熒光強(qiáng)度或波長不能可靠地報(bào)告膜張力。

-脂質(zhì)組成隨時(shí)間變化的系統(tǒng)也可能導(dǎo)致Flipper TR壽命的變化。

-FLIM成像是一種先進(jìn)的顯微鏡技術(shù)，需要商業(yè)化或定制的FLIM顯微鏡系統(tǒng)，具有足夠的激發(fā)激光器、光子計(jì)數(shù)系統(tǒng)和發(fā)射濾波器。建議客戶咨詢儀器負(fù)責(zé)人或聯(lián)系顯微鏡制造商，以確保其系統(tǒng)能夠?qū)lipper TR熒光和壽命進(jìn)行成像。   

相關(guān)文獻(xiàn)：

1)Colom A, et al: A fluorescent membrane tension probe. Nat Chem, 2018, 10:1118–1125. 

2)Dal Molin M, et al: Fluorescent flippers for mechanosensitive membrane probes. JACS, 2015, 137:568-571. 

3)Soleimanpour S, et al: Headgroup engineering in mechanosensitive membrane probes. Chem Commun (Camb) 2016,52:14450-14453.    

Cytoskeleton專注于生物化學(xué)和細(xì)胞過程研究中的純化蛋白和便捷試劑盒開發(fā)與生產(chǎn)。公司提供藥物篩選、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)錄后修飾（PTM）、細(xì)胞骨架研究相關(guān)的系列試劑盒和產(chǎn)品，尤其以細(xì)胞骨架相關(guān)研究見長，既能滿足于樣品較少的科學(xué)研究，也可以用于小規(guī)模篩選研究和高通量大規(guī)模篩選研究。此外，公司還提供微管蛋白，肌動(dòng)蛋白，小G蛋白，GAPs，GEFs等現(xiàn)有產(chǎn)品的藥物篩選服務(wù)。