封閉的原理：

固相載體表面(如Elisa板，NC膜或者PVDF膜上等)有很多孔洞，通過(guò)電轉(zhuǎn)或包被，膠上的蛋白被轉(zhuǎn)移到了膜上，或抗原/抗體固定在了板上，蛋白以機(jī)械填補(bǔ)(堆積)和吸附的方式結(jié)合于表面。蛋白塞進(jìn)了表面的很多孔洞里面，但蛋白覆蓋并不是連續(xù)的，有很多空隙，而且樣品孔之間也有空隙，這些孔洞并沒(méi)有填進(jìn)東西，而抗體也是蛋白，也會(huì)被吸附在空的洞里，這樣就會(huì)有很多非特異性的信號(hào)。   封閉液中的蛋白可以與固相載體表面上的空白空洞位置結(jié)合，同樣以機(jī)械填補(bǔ)(堆積)和吸附覆蓋的方式結(jié)合在膜上，因?yàn)橛小疤钛a(bǔ)”和“覆蓋”蛋白結(jié)合位點(diǎn)以避免一抗的非特異結(jié)合，所以有“封閉”的說(shuō)法。同樣這兩種作用使封閉液中的蛋白能夠很牢固的結(jié)合在空白位置上。這樣抗體蛋白就不會(huì)被非特異性的吸附到膜上，而只會(huì)跟特異性蛋白結(jié)合。

封閉劑的種類(lèi)及選擇依據(jù)：

封閉劑應(yīng)封閉所有的未結(jié)合位點(diǎn)而不替換表面上的靶蛋白、不結(jié)合靶蛋白表位、也不與抗體或檢測(cè)試劑有交叉反應(yīng)。常見(jiàn)的封閉劑主要有以下幾種：  

1、BSA

BSA是最常用的封閉劑，成分單一適用于大多數(shù)情況。若免疫原是偶聯(lián)BSA的， BSA有很強(qiáng)的免疫原性，會(huì)導(dǎo)致產(chǎn)生很多的針對(duì)BSA的抗體，為避免交叉反應(yīng)，不能用BSA、脫脂奶粉等封閉，可以選用酪蛋白或無(wú)蛋白的封閉劑封閉。 大部分BSA中有少量的抗體殘留，會(huì)導(dǎo)致抗原/抗體之間的交叉反應(yīng)，產(chǎn)生高背景，雜帶較多或使得本底水平增高。  

2、正常血清

封閉血清的原理主要有兩點(diǎn)，第一是待檢樣本會(huì)有些與蛋白非特異性結(jié)合的物質(zhì)，從而導(dǎo)致背景過(guò)高，因此可以用BSA或血清封閉掉這部分非特異性的結(jié)合，從這點(diǎn)看，BSA和血清沒(méi)有明顯區(qū)別。第二是待檢樣本中可能會(huì)有Fc受體，可以和抗體恒定區(qū)結(jié)合，與抗體特異性無(wú)關(guān)，封閉血清中有抗體，因此用血清可以封閉掉一抗及二抗和樣本Fc受體之間結(jié)合。BSA則無(wú)法封閉Fc受體。 免疫組化中用血清封閉的較多。封閉血清一般選擇和二抗同一來(lái)源的，血清中動(dòng)物自身的抗體，預(yù)先能和組織中有交叉反應(yīng)的位點(diǎn)發(fā)生結(jié)合，否則在后面的步驟中如果和二抗發(fā)生結(jié)合， 會(huì)造成背景。但要注意封閉用血清中不能含有目標(biāo)蛋白，且與一抗來(lái)源不同。另外二抗因盡量少選取兔子或小鼠來(lái)源的，因?yàn)檫@兩個(gè)在親緣關(guān)系上和人類(lèi)非常接近，所以產(chǎn)生交叉反應(yīng)的機(jī)會(huì)就比較大，從而導(dǎo)致背景比較高。適合選用來(lái)源于驢，山羊，綿羊等的二抗，背景相對(duì)就很低。  

3、脫脂奶粉

脫脂奶粉最大的優(yōu)點(diǎn)是價(jià)格便宜，但是由于成分相對(duì)復(fù)雜，所以適用范圍要狹窄一些。磷酸化抗體也許會(huì)導(dǎo)致背景增加，此外，因?yàn)樽陨砗猩锼?不能用于生物素標(biāo)記的抗體系統(tǒng)。 奶粉蛋白種類(lèi)比BSA多，而WB膜也好，ELISA板也好，表面的微結(jié)構(gòu)都不是那么均勻的，相對(duì)而言，不同分子量蛋白種類(lèi)多的奶粉(BSA只是一種蛋白)，封閉起來(lái)更全面。 脫脂奶粉中含有少量的生物素和堿性磷酸酶殘留，在使用生物素-親和素系統(tǒng)和堿性磷酸酶標(biāo)記的二抗時(shí)，也會(huì)使得高背景或本底水平增高。 由于奶粉的成份復(fù)雜，而且封閉后的載體不易長(zhǎng)期保存，因此在試劑盒的制備中較少應(yīng)用。  

4、酪蛋白

和BSA作用類(lèi)似，普通酪蛋白不易溶解。中性和堿性條件下帶有負(fù)電性，與同樣帶負(fù)電荷膠體金之間存在排斥力，而膜一般都是帶正電荷，會(huì)與酪蛋白有一定的吸附作用，用酪蛋白封閉效果好些。    

常規(guī)的封閉劑各有優(yōu)劣，沒(méi)有任何一種封閉劑能適合所有的實(shí)驗(yàn)，今天給大家?guī)?lái)一款知名免疫試劑供應(yīng)商Rockland生產(chǎn)的，總體效果顯著優(yōu)于傳統(tǒng)的像BSA(牛血清白蛋白)、脫脂奶粉、酪蛋白(Casein)等的封閉劑，他在熒光WB和蛋白芯片微陣列應(yīng)用中表現(xiàn)不俗，同時(shí)也可以用于Elisa，IHC/IF等應(yīng)用~ 

熒光WB封閉劑推薦：

MB-070用于PEPperCHIP? 肽微陣列的封閉，顯示出顯著優(yōu)于其他常規(guī)封閉劑的性能：

其他封閉劑推薦：

以上產(chǎn)品僅用于科研，不能用于醫(yī)療診斷~  

MB-070的引文（截至目前收錄的引文共138篇，篇幅有限僅展示5篇）：

Rieger AC et al. Growth hormone-releasing hormone agonists ameliorate chronic kidney disease-induced heart failure with preserved ejection fraction. Proc Natl Acad Sci USA. (2021) 

van der Weegen Y, Golan-Berman H, Mevissen TET, et al. The cooperative action of CSB, CSA, and UVSSA target TFIIH to DNA damage-stalled RNA polymerase II. Nat Commun. (2020) 

Werner CT et al. Neuroadaptations in the dorsal hippocampus underlie cocaine seeking during prolonged abstinence. Proc Natl Acad Sci USA (2020) 

Spence et al. In vivo proximity proteomics of nascent synapses reveals a novel regulator of cytoskeleton-mediated synaptic maturation. Nature Communications (2019) 

Lombardi AA, Gibb AA, Arif E, et al. Mitochondrial calcium exchange links metabolism with the epigenome to control cellular differentiation. Nat Commun. (2019)   

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