熒光素酶（luciferase）是自然界中能夠產(chǎn)生生物熒光的酶的總稱。熒光素酶可以催化熒光素氧化成氧化熒光素，在熒光素氧化的過程中，會(huì)發(fā)出生物熒光。然后可以通過熒光測(cè)定儀測(cè)定熒光素氧化過程中釋放的生物熒光。熒光素和熒光素酶這一生物發(fā)光體系，可以極其靈敏、高效地檢測(cè)基因的表達(dá)，是檢測(cè)轉(zhuǎn)錄因子與目的基因啟動(dòng)子區(qū)DNA相互作用的一種檢測(cè)方法。

        目前，最有代表性的是從甲蟲中分離得到的螢火蟲熒光素酶（Firefly  luciferase）和從海腎中分離得到的海腎熒光素酶（Renilla  luciferase）。其中螢火蟲熒光素酶作為報(bào)告基因反應(yīng)目的基因表達(dá)的改變，腎熒光素酶作為內(nèi)參基因，為實(shí)驗(yàn)提供統(tǒng)一基準(zhǔn)線（減少內(nèi)在變化因素如培養(yǎng)細(xì)胞的數(shù)目，細(xì)胞轉(zhuǎn)染和裂解的效率對(duì)實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)確性的影響）。

實(shí)驗(yàn)原理

        螢火蟲熒光素酶在氧氣、ATP和鎂離子同時(shí)存在的條件下，催化熒光素氧化，生成氧化熒光素，同時(shí)產(chǎn)生黃綠色光，波長540-600nm。

        腎熒光素酶只需要氧氣就可以催化腔腸素氧化產(chǎn)生藍(lán)光，波長460-540nm，一般檢測(cè)時(shí)選用460nm

        利用熒光素酶與底物結(jié)合發(fā)生化學(xué)發(fā)光反應(yīng)的特性，把感興趣的基因轉(zhuǎn)錄的調(diào)控元件克隆在螢火蟲熒光素酶基因的上/下游，構(gòu)建成熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒。然后轉(zhuǎn)染細(xì)胞，適當(dāng)刺激或處理后裂解細(xì)胞，測(cè)定熒光素酶活性。通過熒光素酶活性的高低判斷刺激前后或不同刺激對(duì)感興趣的調(diào)控元件的影響。

應(yīng)用類型

        由于兩種酶底物和發(fā)光顏色的區(qū)別，且在動(dòng)物體內(nèi)無內(nèi)源性表達(dá)，使其雙報(bào)告基因系統(tǒng)在基因調(diào)控、非編碼RNA靶向互作等研究領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用。

        啟動(dòng)子研究：轉(zhuǎn)錄因子主要通過作用于靶基因的啟動(dòng)子起作用，將目的基因啟動(dòng)子區(qū)序列替換報(bào)告基因F-Luc的啟動(dòng)子，通過共表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子后，報(bào)告基因表達(dá)的改變，來確定轉(zhuǎn)錄因子與靶基因啟動(dòng)子結(jié)合位點(diǎn)及對(duì)靶基因的作用。

        miRNA研究：主要通過作用于靶基因的3’UTR起作用（降解或抑制翻譯），將目的基因3’UTR（野生型和結(jié)合位點(diǎn)突變型）序列構(gòu)建至載體報(bào)告基因螢火蟲熒光素酶的3’端，通過比較過表達(dá)miRNA后，報(bào)告基因表達(dá)的改變（螢光素酶的活性下降還是不變），來確定miRNA與靶基因3’UTR的作用位點(diǎn)。

        熒光素酶檢測(cè)試劑盒(螢火蟲熒光素酶和海腎熒光素酶由于都是非分泌型蛋白，所以在檢測(cè)之前需要對(duì)過表達(dá)細(xì)胞進(jìn)行裂解處理)：

        熒光素酶報(bào)告基因載體：

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