在之前的文章中，我們復(fù)盤了m6A甲基化疑難雜癥&治療方法

N6-甲基腺嘌呤(m6A）是真核生物最常見和最豐富的RNA分子修飾，占所有 RNA 甲基化的 80% 以上。隨著RNA甲基化研究越來越熱，科學(xué)研究界刮起了一陣m6A RNA甲基化研究的颶風(fēng)。站在風(fēng)口的研究學(xué)者們，都選擇了Epigentek品牌的P-9005產(chǎn)品EpiQuik M6A RNA Methylation Quantification Kit（M6A RNA甲基化定量檢測試劑盒）。

試劑盒原理

P-9005使用獨家配方試劑使RNA被高效的結(jié)合吸附在微孔板上。使用特異性捕獲 N6-甲基腺苷抗體和檢測抗體檢測 N6-甲基腺苷 (m6A)。檢測到的信號得到增強，然后通過讀取微孔板分光光度計中 450 nm 波長的吸光度進(jìn)行比色定量。m6A 的量與測得的 OD 強度成正比。

P-9005-中文說明書鏈接

常見問題解答

在使用P-9005試劑盒的過程中，客戶往往會提出各種問題，小艾這里整理了一下常見的四大類FAQ。

一、實驗樣品類

1.試劑盒樣品有沒有種屬限制？

解答：P-9005試劑盒沒有種屬限制，但是需要是提取好的RNA樣品。

2.RNA樣品純度要求和輸入量？

解答：RNA純度要求：A260/280>1.9；A260/230>1.7。無DNA污染；另外RNA序列長度大于80nts，以便RNA可以較好的結(jié)合在板上。

RNA輸入量：對于每次實驗RNA的輸入量是100-300ng。最為理想的RNA的輸入量應(yīng)該是200ng，正如我們所知m6A通常不到總RNA的0.1%。

二、試劑盒類

1.有效期是多久？

解答：客戶收到貨后，有效期6個月。

2.P-9005試劑盒里的組分是否可以單獨購買嗎?

解答：可以單獨購買，但是建議客戶購買完整試劑盒。

3.在Date Sheet中，它沒有告訴我們應(yīng)該使用什么樣的材料來避免RNase，RNase是否會影響這個試劑盒的結(jié)果？

解答：實驗中涉及到的試劑都是不含RNase的，而且當(dāng)RNA結(jié)合在板上后，RNase將不會再影響實驗結(jié)果。

4.客戶的緩沖液是50mM的PH8的tris-鹽酸緩沖液，可以用這個緩沖液分裝嗎？

解答：盡量推薦使用與廠家相同配方的溶液進(jìn)行分裝。其他溶度的緩沖液是否可用，需要客戶自行嘗試。

三、產(chǎn)品說明書類

1.試劑盒孔板數(shù)指的是可以檢測的樣品數(shù)量嗎？

解答：48/96孔試劑盒只能做48/96個test，而不是48/96個樣品。相應(yīng)的試劑會比48孔稍微多一點，因為要考慮到加樣損耗的因素。

2.加樣時RNA樣品體積多少合適？

解答：在與RNA的結(jié)合過程中，建議的200ngRNA的樣本量體積在1-8uL，這樣才能保證最佳的結(jié)合效率。

3.抗體稀釋比例是多少？

解答：CA和DA的原始濃度都是1000X，但是稀釋倍數(shù)不同，CA按照1：1000稀釋，DA按照1：2000稀釋，加大DA的稀釋比例降低背景信號。

4.P-9005做m6A甲基化的話，為什么要用帶濾芯的槍頭？還有在第4步，m6A RNA捕獲時，洗滌的操作溶液是直接用槍頭吸掉呢，還是可以直接倒掉？

解答：這里使用帶濾芯槍頭，目的是最大限度避免移液器帶來的交叉污染。如果客戶操作無誤，用普通槍頭也是可以的；使用手動移液器代替典型的板輕拂/傾倒方法，以確保完全去除緩沖液并最大程度減少孔間污染。注意，將移液槍沿孔的一側(cè)慢慢向底部引導(dǎo)，避免刮擦到孔底表面。

5.加入80ul的結(jié)合液后，再加入RNA，孵育90min后，將BS移除，這時候RNA在哪？

解答：RNA被高效RNA結(jié)合液結(jié)合在孔板底表面。八聯(lián)管孔底表面有預(yù)涂處理，帶正電，RNA的磷酸骨架帶負(fù)電，在BS結(jié)合液（Binding Solution）的作用下，帶負(fù)電的RNA可以穩(wěn)定的結(jié)合在板上。

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