描述：

LifeSensors的PROTAC In Vitro Ubiquitination Assay Kit旨在通過監(jiān)測蛋白質固有的泛素化能力，可以準確預測PROTAC的效率。  

背景：

泛素：泛素為含76個氨基酸組成的高度保守的小分子蛋白質、大小約為8.6 kDa，在蛋白質降解和細胞信號傳導中起著重要作用。泛素具有7個賴氨酸殘基(K6，K11，K27，K29，K33，K48，K63)和一個甲硫氨酸殘基(M1)，泛素之間主要通過賴氨酸殘基和甲硫氨酸殘基進行各種連接，由此產(chǎn)生的泛素鏈產(chǎn)生一定的拓撲結構,可通過對蛋白底物進行修飾并決定底物的功能。泛素可以通過其C-末端與靶蛋白上的賴氨酸殘基的胺基團結合。這種結合被稱為單一泛素化。額外的泛素基團可以通過泛素中的七個賴氨酸殘基之一與初始泛素結合。這些泛素鏈的形成被稱為多泛素化。其中最為研究的多泛素化形式是通過泛素的第48位賴氨酸（K48鏈）形成鏈。單一泛素化已被證明可以改變靶蛋白的定位、活性和/或功能。多泛素化最常見的后果是通過蛋白酶體介導的靶蛋白降解。 

將泛素連接到靶蛋白需要三種不同連接酶的協(xié)同作用，即E1（泛素活化酶）、E2（泛素結合酶）和E3（泛素連接酶），從而在泛素的C-末端和靶蛋白上的賴氨酸殘基的ε-氨基團之間形成異肽鍵。泛素E3連接酶充當骨架蛋白，為泛素結合酶（E2）和目標底物提供停靠位點。通常，E3連接酶介導將泛素從E2硫酯中間體轉移至底物蛋白的酰胺連接（Hershko and Ciechanover, 1998）。除了對底物的泛素化，E3連接酶還可以對自身進行“自我泛素化”。  

檢測原理：

PROTAC In Vitro Ubiquitination Assay Kit該檢測方法的核心是使用預涂有專有的TUBE試劑（檢測板）的微孔板條，用于捕獲PROTAC依賴反應中形成的多泛素鏈。在檢測過程中，首先將PROTAC加入到檢測板中，然后加入E3連接酶和待檢測的目標蛋白，以形成三元復合物。接下來，將含有野生型泛素和ATP的E1-E2酶混合物加入到孔中，以啟動PROTAC介導的泛素化反應。在反應過程中，E1-E2-E3機制生成的多泛素鏈被識別并捕獲在孔中。在反應和隨后的洗滌步驟后，將分離的多泛素化產(chǎn)物與目標蛋白的抗體（不包含在內(nèi)）和與-HRP偶聯(lián)的二抗（包含在內(nèi)）一起孵育，以便通過化學發(fā)光進行檢測。因此，在這種“三明治”ELISA樣的檢測方法中，捕獲的多泛素化產(chǎn)物產(chǎn)生的信號是PROTAC活性的定量指標。

優(yōu)勢：

1：以高通量篩選格式，通過監(jiān)測泛素化來監(jiān)測PROTAC在選擇的靶蛋白上的活性。 

2：同時篩選多個具有不同配體、退出載體和化學連接物的PROTAC變體。 

3：準確確定潛力的排名順序，為藥物化學家提供可靠的結構活性關系（SAR）指導。 

4：通過合理設計依賴于報告蛋白質“泛素化潛力”的功能性測定的PROTAC，加快PROTAC藥物的發(fā)現(xiàn)和臨床開發(fā)，而不僅僅依賴于簡單的鄰近配體測定。 

5：適用于分子膠粘劑藥物的發(fā)現(xiàn)。  

組分：

注意：將所有材料儲存于-80?C，避免多次凍融循環(huán)。所有組分至少穩(wěn)定保存2個月。

1：體外泛素化檢測板：注意不要將檢測板迅速解凍至室溫。建議最初將檢測板放置在4°C下30分鐘，然后再轉移到室溫下。

2：10倍檢測緩沖液：規(guī)格：1.2 mL，注意：在1倍檢測緩沖液中新鮮添加β-巰基乙醇，最終濃度為1mM。

3：E3混合液（2倍濃度）：規(guī)格：1 x 250 ul（20倍濃度），注意：將選擇的目標蛋白以40-80 nM的濃度加入提供的E3混合液中，以促進PROTAC和E3連接酶的三元復合物形成。

4：E1-E2-泛素混合液（2倍濃度）：規(guī)格：1 x 250 ul（20倍濃度） 

5：二抗（抗小鼠或抗兔HRP偶聯(lián)）：規(guī)格：60uL（100倍濃度） 

6：檢測試劑1和2：規(guī)格：1 mL的檢測試劑1和1 mL的檢測試劑2 

7：阻斷濃縮液（5倍濃度）：規(guī)格：5 mL 

8：陽性對照試劑 

DMSO中的PROTAC（50倍濃度）：10 uL（MZP54，dBET6，A1874） 

目標蛋白陽性對照BRD3（20倍濃度）：20 uL 

抗-BRD3抗體（100倍濃度）：5 uL 

抗小鼠HRP偶聯(lián)物（100倍濃度）：5 uL   

相關產(chǎn)品推薦：

LifeSensors成立于1996年，位于美國賓夕法尼亞州費城，是一家為藥物發(fā)現(xiàn)與研究提供方法和可行性技術方法的生物技術公司，目前主要的產(chǎn)品有400多種，其產(chǎn)品主要覆蓋泛素和泛素蛋白酶體通路等科學應用領域，并且公司擁有兩大獨家技術平臺：用于細胞信號和藥物發(fā)現(xiàn)的泛素蛋白酶體系統(tǒng)(UPS)，以及增強目的蛋白在大腸桿菌、酵母、昆蟲和哺乳動物細胞中表達與純化的SUMO融合表達系統(tǒng)，此外，LifeSensors還為泛素的蛋白質組學提供眾多定制技術服務，并且已經(jīng)開發(fā)了各種各樣的測定細胞中的生理底物或生物標志物的方法。   

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