出于多種考慮，將小組織片段簡(jiǎn)單浸泡在固定液中便能得到合適的固定，對(duì)大多數(shù)組織來(lái)說(shuō)可能是唯一的固定模式。然而更快、更均一的固 定方法是將固定液通過(guò)管道系統(tǒng)如心主動(dòng)脈或腹部主動(dòng)脈灌注到組織中。下面介紹一下用 4% 多聚甲醛固定大鼠大多數(shù)器官的操作步驟。

材料

麻醉劑

手術(shù)用剪刀、鑷子、止血鉗

鋸齒小鑷子

手術(shù)刀

放置樣品的帶塞子的小瓶 (5-10ml)

0.9% 生理鹽水

500ml 燒杯

4% 多聚甲醛、固定液

手套、防護(hù)眼鏡

蠕動(dòng)泵（或?qū)抗潭ㄔ诰嗍中g(shù)臺(tái)上方 150cm 處，口向下）

心主動(dòng)脈灌注用輸液針，長(zhǎng) 50mm，外徑 1.3-1.5mm

帶有靜脈輸血用的滴注腔的灌注裝置

心臟灌注固定法

1.設(shè)置蠕動(dòng)泵，安裝灌注裝置和輸液針。首先，取 100ml 水沖洗管道除去管內(nèi)殘留物，然后燒杯盛滿(mǎn) 4% 冷多聚甲醛（冰盒預(yù)冷），將灌注 管末端置入燒杯中。溶液體積應(yīng)該與動(dòng)物大小成比例，通常對(duì)于一只動(dòng)物來(lái)說(shuō) 100-200ml 足夠。打開(kāi)閥門(mén)，調(diào)節(jié)到一個(gè)緩慢而穩(wěn)定的速度 (20ml/min)，然后關(guān)閉閥門(mén)。

2.在操作臺(tái)上將剪刀、鑷子和止血鉗放在適宜操作的位置。給動(dòng)物注射合適劑量的麻醉劑。動(dòng)物一旦處于麻醉狀態(tài)后，將其背部向下放在操 作臺(tái)上。可以使用帶子固定確保動(dòng)物不動(dòng)。

3.用捏反應(yīng)法檢測(cè)麻醉程度。在開(kāi)始下述操作之前確保動(dòng)物是無(wú)反應(yīng)的。

4.在腹部用手術(shù)刀沿著膈肌切一個(gè)口，用鋒利的剪刀剪開(kāi)膈肌底部連著的組織，確保能進(jìn)入胸腔。

5.取大號(hào)剪刀，鈍端向下，切穿左胸肋廓。

6.橫向切穿肋骨一到兩厘米，打開(kāi)胸腔。用止血鉗打開(kāi)，使心臟暴露出來(lái)。準(zhǔn)備排血和輸液裝置。

7.用鑷子固定住心臟（心臟應(yīng)該還在跳動(dòng)），在左心室跳動(dòng)部位直接插入針頭，垂直外露 5mm。注意針頭不要插入太多，以防刺破心室壁 影響溶液循環(huán)！用止血鉗將針頭固定在輸入口。打開(kāi)閥門(mén)使 0.9% 的生理鹽水以緩慢、穩(wěn)定的流速大約 20ml/min 輸入動(dòng)物體內(nèi)。

8.用剪刀在心房處剪一個(gè)口，保證溶液自由流動(dòng)。如果溶液不能自由流出或溶液從動(dòng)物的鼻孔或口腔流出，則要讓針頭復(fù)位。

9.當(dāng)血液快排干時(shí)，換上 4% 多聚甲醛溶液（200-300ml）。

(換液時(shí)注意不要引入氣泡。灌注過(guò)程中最好帶上防護(hù)眼鏡，因?yàn)橛袝r(shí)連接的管道會(huì)崩開(kāi)使固定液噴射到眼睛里。)

當(dāng)肝臟自發(fā)跳動(dòng)（福爾馬林“跳舞”）及顏色變淺時(shí)表明灌注完成。（注：一般地，一只成年大鼠的灌注時(shí)間大約是 30-60 分鐘，但是根據(jù) 動(dòng)物大小和技術(shù)的不同也有所差別）。

10.終止灌注，切除靶組織，放置盛有同種固定液的小瓶中，冰上或 4°C 固定 2 小時(shí)，再脫水包埋。4°C 浸泡過(guò)夜固定，效果更好。

腹主動(dòng)脈灌注法

1.按上述方法準(zhǔn)備材料和動(dòng)物（步驟 1-3）。

2.在腹部正中橫向剪開(kāi)一個(gè)長(zhǎng)切口，打開(kāi)腹腔，將腸道輕輕推至腹腔左側(cè)。

3.小心地將腎主動(dòng)脈始端下方的主動(dòng)脈露出。輕輕地將腹主動(dòng)脈與覆蓋其上的脂肪組織及其它粘聯(lián)組織剝離開(kāi)。

4.用小鑷子將主動(dòng)脈壁牢牢地固定在距遠(yuǎn)端 0.5-1.0cm 分叉處。然后將折針緊貼鑷子插入主動(dòng)脈腔的近心端。

5.快速連續(xù)操作以下步驟:

a. 用小剪刀在下腔靜脈剪開(kāi)一個(gè)口。

b. 灌注。

c.夾住膈肌下方腎主動(dòng)脈始端上方的主動(dòng)脈。

操作時(shí)，精確度和速度是非常重要的。因此，固定步驟最好兩個(gè)人操作。

灌注開(kāi)始后迅速夾住主動(dòng)脈至關(guān)重要，最簡(jiǎn)單的方法就是用手指（帶手套）抵住腹腔的后壁壓住主動(dòng)脈，

然后換上止血鉗。最后切除受壓上游的主動(dòng)脈。

6.腎臟表面呈現(xiàn)顏色均一、變淺發(fā)白時(shí)表明灌注完成。灌注一只成年大鼠來(lái)說(shuō)流速至少要控制在 60-100ml/min。灌注 3 分鐘。終止灌注，切 除并清理靶組織，并將之放置到盛有同種固定液的小瓶中（見(jiàn)后面的固定步驟），冰上或 4°C 固定 2 小時(shí)。4°C 浸泡過(guò)夜固定，效果更好。

7.脫水包埋組織。