一、鼠對鼠染色注意事項(xiàng)

用鼠抗體對鼠組織染色是個復(fù)雜的過程，因?yàn)槿菀讓?dǎo)致背景染色高，而且很難消除。 形成這種背景主要是由于組織染色時二抗與內(nèi)源性的鼠 IgG，或 B 細(xì)胞、漿細(xì)胞及巨噬細(xì)胞上的 Fc 受體結(jié)合造成的。

不能保證鼠單克隆抗體與鼠組織（除非說明書有顯示）。然而，必需鼠對鼠染色時，應(yīng)用一些竅門可能會有助于減少這些背景染色。

封閉內(nèi)源性 IgG

1.按常規(guī)制備組織切片。

2.在封閉步驟，用血清（與二抗同種動物來源）室溫封閉 30 分鐘。

3.PBS-吐溫-20 沖洗 3 X 2 分鐘。

4.組織切片與未結(jié)合的抗鼠 IgG 的 AffiniPure Fab 片段（H+L）室溫孵育 1 小時或 4°C 過夜。建議封閉抗體濃度用 0.1 mg/ml，但是否是最佳濃度仍需終端用戶來評估。

5.抗體染色。

封閉內(nèi)源性Fc受體

以單克隆二抗F（ab）段封閉內(nèi)源性 Fc 受體，有市售試劑盒。

有助于降低背景染色的其它竅門

1.切片在含 1% Triton 的 PBS 中室溫孵育 30 分鐘，“清凈”組織。

2.TBS–吐溫-20 作為沖洗緩沖液比 PBS-吐溫-20 更能減少背景染色。

二、疑難解答提示

無染色

一抗和二抗不匹配

使用針對一抗的二抗（如一抗來自兔，二抗為抗兔抗體）

沒有足夠的一抗與目標(biāo)蛋白結(jié)合

使用低稀釋度抗體。延長 4℃ 孵育時間（如過夜）。

抗體的天然結(jié)構(gòu)（3D 形態(tài)）受損不適用于 IHC

用天然（非變性的）WB法檢測抗體，確保抗體沒被損壞。

由于不當(dāng)儲存、稀釋或反復(fù)凍融造成一抗/二抗試劑盒失效

做陽性對照確認(rèn)一抗/二抗試劑盒的有效性。

靶組織中沒有目標(biāo)蛋白

參照抗體供應(yīng)商的建議做陽性對照。

組織中沒有足夠的目標(biāo)蛋白

應(yīng)用信號放大操作。

沒有避光保存二抗

避免將二抗處于光照下。

脫蠟不徹底

延長脫蠟時間，更換二甲苯。

固定步驟（使用福爾馬林和多聚甲醛固定劑）修飾了抗體識別表位

抗原修復(fù)法暴露出抗原表位，縮短固定時間。

蛋白位于細(xì)胞核內(nèi)（核蛋白），抗體不能穿透核膜

在封閉液和抗體稀釋液中加入通透劑。

PBS 緩沖液被細(xì)菌污染后破壞了靶蛋白的磷酸根

在抗體 PBS 儲存液中加入 0.01% 疊氮化合物，或使用新鮮無菌的 PBS。

高背景

沒有封閉非特異性結(jié)合或封閉不充分

延長封閉時間，并考慮改換封閉劑。Abcam 建議用 10% 正常血清封閉切片 1 小時或 1-5% BSA 封閉培養(yǎng)細(xì)胞 30 分鐘。

一抗?jié)舛冗^高

滴定法尋找到最佳抗體濃度，或在濃度較低抗體中延長孵育時間（最好是緩慢而準(zhǔn)確地結(jié)合）。

孵育溫度過高

4°C 孵育切片或細(xì)胞

二抗發(fā)生了非特異性結(jié)合（被損壞）

不加一抗，做二抗對照。

組織沖洗不徹底，有固定劑殘留

所有步驟都要用 PBS 充分洗滌。

存在內(nèi)源性過氧化物酶活性

用酶抑制劑如抑制堿性磷酸酶的鹽酸左旋咪唑 (2mM)，或抑制過氧化物酶的 H2O2 (0.3% v/v)。

固定過度（固定劑用福爾馬林和多聚甲醛）導(dǎo)致抗體識別抗原位點(diǎn)被修飾

改變抗原修復(fù)方法，縮短與抗原修復(fù)液的孵育時間。

信號過度放大（信號放大技術(shù)）

縮短信號放大孵育時間，稀釋信號擴(kuò)大試劑盒。

底物過量（酶檢測法）

縮短底物孵育時間

染料與 PBS 在細(xì)胞/組織中相互作用（酶檢測法）

用 Tris 緩沖液沖洗切片后，再與底物孵育。孵育后，Tris緩沖液再次沖洗細(xì)胞/切片。

通透作用破壞膜并除去了膜蛋白

去除緩沖液中的通透劑

非特異性染色

一抗/二抗?jié)舛冗^高

降低抗體濃度和或縮短孵育周期。對比不表達(dá)目標(biāo)蛋白細(xì)胞的信號強(qiáng)度。

存在內(nèi)源性過氧化物酶活性

用酶抑制劑如抑制堿性磷酸酶的鹽酸左旋咪唑 (2mM)，或抑制過氧化物酶的 H2O2 (0.3% v/v)。

一抗與被染組織同源(如用鼠一抗測鼠組織)，加二抗后，二抗會與同源的所有組織結(jié)合

應(yīng)用與組織非同源的一抗

切片/細(xì)胞變干

保持切片/細(xì)胞濕度，切勿變干。