一細胞復蘇與培養(yǎng)

將液氮或-80oC 保存的腫瘤細胞于 37oC 水浴, 快速溶化, 用 8.0ml 培養(yǎng)基混勻已融化的腫瘤細胞懸液, 于 1500 轉/分, 離心 3 分鐘。棄上清, 再吸取 8.0ml 培養(yǎng)基質混勻細胞沉淀, 再 1500 轉/分, 離心 3 分鐘, 棄上清, 細胞沉淀用 1.0ml 培養(yǎng)基混勻, 備用。 另取一個 75cm2 方瓶, 加入 14.0ml 培養(yǎng)基質, 將上述制備的含腫瘤細胞懸液(1.0ml)加入此方瓶中, 于 37oC，5%CO2 孵育箱中培養(yǎng)。

若此腫瘤細胞懸浮生長, 大約 3－4 天細胞基質會變黃, 5.0ml 細胞懸液可傳代一個方瓶培養(yǎng), 可用 3－4 個方瓶培養(yǎng), 一個方瓶中呈對數(shù)生長的腫瘤細胞可達 1—1.5×107 個, 根據(jù)試驗所需, 可決定傳代的次數(shù)。 若此腫瘤細胞呈貼壁生長, 經過 3—4 天, 腫瘤細胞生長至 80%—95% 單層時, 棄上清, 用 0.5mM 的EDTA(難消化的腫瘤細胞用0.25%胰酶1.0ml), 處理腫瘤細胞大約 3—5 分鐘, 用倒置顯微鏡觀察，當 90% 的腫瘤細胞變圓時, 即可用彎管吹打并將消化的細胞轉移到 15ml 離心管中, 于 1500 轉/分下，離心 3 分鐘, 棄上清, 加少許培養(yǎng)基混勻, 可傳代 3 個 75cm2方瓶擴大培養(yǎng)。

二細胞凍存

將對數(shù)生長的腫瘤細胞用 1 個 75cm2方瓶按上述方法收集, 于 1500 轉/分離心 3 分鐘,棄上清, 用保種液(含 10% DMSO 的小牛血清)3.0ml 混勻, 分別加入到 2—3 只保種管中, 寫上腫瘤細胞名稱, 時間, 保種者姓名, 放-80o C 保存, 次日將它們轉移到液氮中保存(注: -80o C 下可保存細胞半年至一年, 液氮可保存細胞 5—10 年, 甚至更長的時間)。以上所有物品均需經過高溫滅菌( 121oC, 30 分
鐘)，培養(yǎng)基質則經過過濾(0.22uM)除菌, 所有操作均必須遵守無菌操作技術, 避免細菌、真菌、病原體、衣原體等污染。