核因子紅細(xì)胞2相關(guān)因子（Nuclear factor erythroid 2-related factor，Nrf2）是一種轉(zhuǎn)錄因子，通過與抗氧化應(yīng)答元件（antioxidant response element，ARE）區(qū)域的啟動(dòng)子結(jié)合，增加抗氧化蛋白的表達(dá)，從而協(xié)調(diào)抗氧化和抗炎反應(yīng)。在基礎(chǔ)條件下，Nrf2被細(xì)胞骨架的Kelch樣ECH關(guān)聯(lián)蛋白1（Kelch-like ECH-associated protein 1，Keap1）保留在細(xì)胞質(zhì)中，并促進(jìn)Nrf2的泛素化和降解。正常情況下，人體內(nèi)氧化和抗氧化體系基本處于動(dòng)態(tài)平衡。一旦平衡被打破，機(jī)體處于過度氧化負(fù)荷下抗氧化物質(zhì)耗竭或活性下降，則過多的活性氧自由基就可能攻擊靶器官造成組織器官和生物大分子如DNA、RNA、蛋白質(zhì)、脂質(zhì)的損傷。一般情況下，Nrf2定位于細(xì)胞質(zhì)，并與Keap1相互作用，泛素化后被泛素蛋白酶體途徑迅速降解。當(dāng)細(xì)胞受到氧化應(yīng)激時(shí)，Keap1蛋白域的結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，導(dǎo)致Nrf2從Keap1中釋放出來，導(dǎo)致Nrf2蛋白不能被降解從而進(jìn)入細(xì)胞核，結(jié)合到ARE上，并誘導(dǎo)抗氧化應(yīng)答基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，保護(hù)細(xì)胞免受氧化損傷。研究表明，運(yùn)用小分子抑制劑直接阻斷KEAP1-NRF2蛋白-蛋白相互作用可調(diào)節(jié)抗氧化基因的表達(dá)，預(yù)防正常細(xì)胞惡變，發(fā)揮抗癌作用，

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Keap1-Nrf2抑制劑篩選試劑盒旨在利用熒光偏振（fluorescence polarization，F(xiàn)P）技術(shù)，通過監(jiān)測(cè)熒光標(biāo)記分子與配體結(jié)合時(shí)的旋轉(zhuǎn)運(yùn)動(dòng)性變化，來鑒定Keap1-Nrf2結(jié)合抑制劑。FP是一種用于研究分子相互作用的強(qiáng)大工具。該試劑盒包含足夠量的純化Keap1蛋白、熒光標(biāo)記Nrf2肽和用于100個(gè)結(jié)合反應(yīng)的試劑緩沖液。為了確定抑制劑對(duì)Keap1-Nrf2復(fù)合物形成的影響，將Keap1蛋白和熒光Nrf2肽與或不與測(cè)試抑制劑一起孵育30分鐘。使用能夠測(cè)量熒光偏振的多功能微孔酶標(biāo)儀測(cè)量Nrf2肽的旋轉(zhuǎn)運(yùn)動(dòng)性變化。

結(jié)果賞析：

左圖：Keap1與Nrf2的結(jié)合。右圖：Nrf2抑制劑抑制Keap1-Nrf2結(jié)合。 結(jié)合情況使用Keap1:Nrf2抑制劑篩選試劑盒（BPS Bioscience #72020）進(jìn)行檢測(cè)。Nrf2抑制劑KI696與Nrf2肽和Keap1在逐漸增加的濃度下孵育。熒光偏振度在λex 485nm，λem 530 nm下使用熒光偏振的多功能微孔酶標(biāo)儀測(cè)量。   

文獻(xiàn)案例：

在這項(xiàng)研究中，報(bào)道了一種新的6-shogaol衍生物（shogaol噻吩化合物（STC）），通過多種機(jī)制（KEAP1獨(dú)立和依賴）改善了其NRF2活性，降低了與巰基的反應(yīng)性（可能改善了其生物作用的選擇性并減少了毒性），并在肝臟微粒體中具有代謝穩(wěn)定性。使用可重復(fù)使用的催化劑（脯氨酸-脯氨酸二肽）采用新的合成方法，在良好的產(chǎn)率（>85%）和純度（~95%）下合成了STC。STC具有良好的藥物樣性質(zhì)和生物活性，優(yōu)于6-shogaol。與6-shogaol相比，STC表現(xiàn)出更顯著的抗炎作用，通過NRF2依賴和NRF2非依賴機(jī)制（未來的研究應(yīng)進(jìn)一步闡明這一方面）。在該研究中，他們就是用的BPS Bioscience Keap1-Nrf2相互作用的抑制劑篩選試劑盒來確定STC在抑制KEAP1-NRF2相互作用方面的效果的。

BPS Bioscience，生物酶研究專家，可提供活性酶、蛋白酶活性/抑制劑篩選檢測(cè)試劑盒、慢病毒等，產(chǎn)品涉及臨床前藥物開發(fā)過程的每個(gè)階段，包括磷酸酶、組蛋白去甲基化酶、組蛋白甲基化轉(zhuǎn)移酶、HDACs、聚ADP核糖聚合酶（PARP）等熱門指標(biāo)的蛋白酶及酶活/抑制劑篩選檢測(cè)試劑盒。詳情清咨詢艾美捷科技：http://m.zihai029.com/