解析文章《Tumour reoxygenation after intratumoural hydrogen peroxide (KORTUC) injection: a novel approach to enhance radiosensitivity》

作者：

Samantha Nimalasena ^1,2,5 , Selvakumar Anbalagan ^1,5 , Carol Box ¹ , Sheng Yu ¹ , Jessica K. R. Boult ¹ , Nigel Bush ¹ , Louise Howell ³ ,Victoria Sinnett ² , William Murphy ⁴ , John Yarnold ¹ , Simon P. Robinson ¹ and Navita Somaiah ^{1,2 ?}

鏈接：https://www.ahajournals.org/doi/full/10.1161/CIRCRESAHA.118.314438

一、研究背景

1.腫瘤缺氧與放療抗性

腫瘤缺氧是放療抗性的一個(gè)重要原因。自 20 世紀(jì) 50 年代 Gray 等人的開創(chuàng)性研究以來，人們一直在尋求增加氧合以提高放療效果的策略。

2.KORTUC 的潛在作用

前期臨床和臨床研究報(bào)道了瘤內(nèi)注射過氧化氫（H?O?）作為實(shí)體瘤潛在放療增敏劑的可能性。KORTUC 是將 H?O?與 0.83% 透明質(zhì)酸鈉凝膠混合制成的 0.5% H?O?溶液，用于體內(nèi)注射，以確保穩(wěn)定性并減少注射疼痛。作者所在的 I 期臨床試驗(yàn)已證實(shí)其在局部晚期乳腺癌中的安全性，并顯示出有希望的腫瘤反應(yīng)。當(dāng) H?O?與電離輻射聯(lián)合應(yīng)用于放療抗性細(xì)胞系和小鼠腫瘤模型時(shí)，觀察到增強(qiáng)的細(xì)胞毒性作用和顯著的腫瘤生長延遲，其機(jī)制不僅與輻射導(dǎo)致的 DNA 損傷增強(qiáng)有關(guān)，還涉及溶酶體膜透化、重金屬離子釋放、線粒體膜破壞和細(xì)胞凋亡等。瘤內(nèi)注射 KORTUC 后，H?O?分解產(chǎn)生水和氧氣，或在亞鐵離子存在下產(chǎn)生氧氣和羥基自由基，氧氣微泡的形成可用于引導(dǎo)藥物在腫瘤內(nèi)的傳遞，這促使作者研究其是否可通過再氧合作用來增強(qiáng)放療敏感性。

二、研究方法

1.細(xì)胞培養(yǎng)

培養(yǎng)人 HCT116 結(jié)直腸癌細(xì)胞和 LICR - LON - HN5 頭頸部癌細(xì)胞，使用 Dulbecco’s modified eagle’s medium 補(bǔ)充 10% 胎牛血清，在特定條件下培養(yǎng)，并通過短串聯(lián)重復(fù)（STR）分析和 PCR 分析對(duì)細(xì)胞系進(jìn)行驗(yàn)證和支原體檢測(cè)。

2.藥物制備

在完全細(xì)胞培養(yǎng)基中制備過氧化氫的系列稀釋液（0 - 9.6 mM）。對(duì)于瘤內(nèi) KORTUC 注射，將 3% v/v 過氧化氫與透明質(zhì)酸鈉凝膠混合，在無菌條件下制備成最終臨床濃度為 150mM 0.5% v/v 的溶液。

3.Spheroid 實(shí)驗(yàn)

（1）將細(xì)胞接種在超低附著 96 孔板中形成球狀體。在第 4 天，用不同濃度的 H?O?處理球狀體。

（2）對(duì)于缺氧的免疫組化檢測(cè)，球狀體在固定前用 200?M pimonidazole（Hypoxyprobe? - 1，HP - 100）孵育 24h，然后進(jìn)行一系列處理和染色，包括用抗 pimonidazole 抗體檢測(cè)生物還原加合物以及用 DAPI 復(fù)染細(xì)胞核等，并對(duì)球狀體直徑和平均熒光強(qiáng)度進(jìn)行量化。

（3）對(duì)于實(shí)時(shí)缺氧成像，球狀體用 5?M Image - iT? Red Hypoxia Reagent 孵育 24h，然后用相同濃度范圍的 H?O?處理，在不同時(shí)間點(diǎn)獲取明場(chǎng)和熒光圖像。

4.Xenograft 實(shí)驗(yàn)

（1）將腫瘤細(xì)胞注射到六周齡雌性 Foxn1 裸鼠皮下，當(dāng)腫瘤體積達(dá)到約 400mm? 時(shí)進(jìn)行處理，將小鼠隨機(jī)分為三組：非注射對(duì)照組、載體注射對(duì)照組（僅透明質(zhì)酸鈉）和 KORTUC 組（透明質(zhì)酸鈉 + H?O?）。

（2）瘤內(nèi) KORTUC 注射時(shí)，小鼠經(jīng)腹腔注射麻醉，在超聲引導(dǎo)下進(jìn)行注射，注射后對(duì)腫瘤進(jìn)行不同時(shí)間的觀察和處理。

5.Dual hypoxia marker 技術(shù)

通過腹腔注射 2 - nitroimidazole CCI - 103F（Hypoxyprobe - F6，HP4 - 100）確定基線腫瘤缺氧情況，然后在超聲引導(dǎo)下瘤內(nèi)注射 KORTUC 或載體，再腹腔注射 pimonidazole（Hypoxyprobe，60mg/kg），最后處死小鼠，獲取腫瘤組織進(jìn)行一系列處理和染色，包括用不同抗體檢測(cè)相關(guān)標(biāo)記物，并進(jìn)行圖像采集和分析。

6.圖像分析

使用 cellSens 和 Fiji（ImageJ 應(yīng)用）對(duì)圖像進(jìn)行分析，包括定義和量化缺氧加合物形成，確定再氧合區(qū)域，以及對(duì) phospho - ATM 焦點(diǎn)進(jìn)行量化等。

三、Hypoxyprobe 品牌的 HP - 100 試劑盒產(chǎn)品的作用和價(jià)值

產(chǎn)品鏈接：

http://site.hypoxyprobe.com/knowledge-center-articles/MSDS_HP_2_24.pdf

Substance Name ：Pimonidazole Hydrochloride

Brand Name ：Hypoxyprobe?-1

Company ：Hypoxyprobe, Inc (HPI)

1.在 Spheroid 實(shí)驗(yàn)中的作用

在球狀體缺氧的免疫組化檢測(cè)中，使用 Hypoxyprobe? - 1（HP - 100）試劑盒中的 pimonidazole。球狀體在固定前用 200?M pimonidazole 孵育 24h，通過檢測(cè)生物還原加合物來確定缺氧情況。這對(duì)于研究 H?O?處理對(duì)球狀體缺氧的影響至關(guān)重要，能夠提供球狀體內(nèi)部缺氧狀態(tài)的準(zhǔn)確信息，幫助研究人員了解不同濃度 H?O?處理下球狀體缺氧的變化規(guī)律。

2.在 Xenograft 實(shí)驗(yàn)中的作用

在 Dual hypoxia marker 技術(shù)中，首先腹腔注射 2 - nitroimidazole CCI - 103F（Hypoxyprobe - F6，HP4 - 100）來確定基線腫瘤缺氧情況。然后在瘤內(nèi)注射操作后，又腹腔注射 pimonidazole（Hypoxyprobe，60mg/kg）來進(jìn)一步檢測(cè)腫瘤缺氧的變化。這些操作能夠全面、準(zhǔn)確地評(píng)估瘤內(nèi)注射 KORTUC 前后腫瘤缺氧狀態(tài)的改變，為研究腫瘤再氧合機(jī)制提供了關(guān)鍵的數(shù)據(jù)支持。

Hypoxyprobe? F6 Kit

(HPI Catalog # HP4-XXX)

Kit contents:

Solid CCI-103F (Hypoxyprobe?-F6)

Diluted Rabbit anti-CCI-103F antisera (PAbF6)

應(yīng)用: 使用Hypoxyprobe?-F6 Kit通過免疫化學(xué)檢測(cè)（包括免疫過氧化物酶、免疫熒光或流式細(xì)胞術(shù)）測(cè)量組織和細(xì)胞中的缺氧。

3.總體價(jià)值

Hypoxyprobe 品牌的相關(guān)試劑盒產(chǎn)品為研究腫瘤缺氧和再氧合提供了有效的工具。通過使用這些試劑盒中的試劑，可以準(zhǔn)確地標(biāo)記和檢測(cè)腫瘤組織及球狀體中的缺氧區(qū)域，使得研究人員能夠定量分析缺氧程度的變化，對(duì)于深入了解 KORTUC 對(duì)腫瘤缺氧的影響以及其放療增敏機(jī)制具有不可替代的價(jià)值。

四、實(shí)驗(yàn)結(jié)果

1.H?O?誘導(dǎo)的再氧合在 3D 球狀體模型中呈劑量和時(shí)間依賴性

Pimonidazole 加合物形成證實(shí)了 HCT116 和 HN5 球狀體模型中存在缺氧。Image - iT? Red 熒光在 H?O?處理后 1h 呈劑量依賴性降低，在 [H?O?]≥1.2 mM 時(shí)顯著，與球狀體再氧合一致。在 HCT116 球狀體中，缺氧降低可持續(xù)到處理后 6h（≥2.4 mM H?O?），但在 24h 時(shí)熒光重新出現(xiàn)，表明缺氧再次出現(xiàn)。H?O?處理 24h 后對(duì)球狀體進(jìn)行 pimonidazole 加合物染色也進(jìn)一步證實(shí)了球狀體再氧合，且在 [H?O?]>1.2 mM 時(shí)觀察到該效果。

2.超聲成像證實(shí)瘤內(nèi) KORTUC 注射后 O?持續(xù)釋放

在臨床和實(shí)驗(yàn)中，瘤內(nèi)注射 KORTUC 后會(huì)立即形成氧氣微泡，在異種移植模型中也觀察到了這種現(xiàn)象。對(duì) HCT116 腫瘤的超聲成像顯示，氧氣微泡的回聲性逐漸降低，但在注射后可持續(xù) 1h，而注射透明質(zhì)酸鈉時(shí)未觀察到微泡形成，證實(shí)瘤內(nèi) H?O?可導(dǎo)致氧氣微泡持續(xù)釋放。

3.瘤內(nèi) KORTUC 顯著降低 HCT116 和 HN5 異種移植物的腫瘤缺氧

通過對(duì) CCI - 103F 和 pimonidazole 加合物形成的量化，發(fā)現(xiàn)瘤內(nèi) KORTUC 注射導(dǎo)致兩種異種移植物模型中的腫瘤缺氧顯著降低，與載體或非注射對(duì)照組相比，差異顯著。而注射透明質(zhì)酸鈉的腫瘤缺氧降低不顯著。

4.KORTUC 治療導(dǎo)致 phospho - ATM 焦點(diǎn)增加，提示再氧合和 ROS 增加

在 HCT116 異種移植物中，對(duì) phospho - ATM 焦點(diǎn)進(jìn)行評(píng)分，發(fā)現(xiàn) KORTUC 注射組中 > 5 phospho - ATM 焦點(diǎn)的細(xì)胞顯著多于對(duì)照組。在 CCI - 103F 陽性和陰性細(xì)胞中均有此現(xiàn)象，推測(cè) CCI - 103F 陽性細(xì)胞中增加的 phospho - ATM 表達(dá)可能是由于 ROS 和 / 或再氧合誘導(dǎo)的 ROS 的共同作用，而 CCI - 103F 陰性細(xì)胞中可能是由于 ROS 單獨(dú)作用。

五、研究結(jié)論

1.腫瘤缺氧的改善

瘤內(nèi)注射 KORTUC 可導(dǎo)致腫瘤缺氧減少，在 3D 球狀體和來自兩種不同癌細(xì)胞系的異種移植物模型中均得到證實(shí)，且在體內(nèi)注射后 1h 內(nèi)缺氧降低得以維持。

2.放療增敏機(jī)制

這種機(jī)制可用于克服缺氧誘導(dǎo)的放療抗性，且與正在進(jìn)行的 II 期臨床試驗(yàn)中放療的實(shí)施時(shí)間相吻合。此外，瘤內(nèi) KORTUC 注射還導(dǎo)致 ATM 激活，表明除再氧合外，還增加了 ROS 水平。

3.臨床應(yīng)用前景

如果正在進(jìn)行的乳腺癌隨機(jī)對(duì)照試驗(yàn)（KORTUC II 期）證實(shí)其療效，該方法可能在其他腫瘤類型中廣泛應(yīng)用，尤其是在放療是主要治療手段且缺氧是不良預(yù)后和預(yù)測(cè)生物標(biāo)志物的腫瘤中。