Bst聚合酶，作為一種特殊的DNA聚合酶，因其獨(dú)特的特性和廣泛的應(yīng)用而備受關(guān)注。

基于Bst聚合酶的活性，Saphir-Bst GreenMaster凍干液在恒定溫度（60至65°C）下快速、穩(wěn)健的擴(kuò)增DNA。該酶顯示出高轉(zhuǎn)移置換活性，并產(chǎn)生高達(dá)109的擴(kuò)增因子，這與PCR測(cè)定中的約.30個(gè)循環(huán)相當(dāng)。Saphir-Bst GreenMaster凍干液允許在10-20分鐘內(nèi)檢測(cè)目標(biāo)基因。

艾美捷Bst聚合酶/Saphir Bst GreenMaster凍干粉（PCR-398S）含有Saphir Bst聚合酶、dNTPs（去氧核苷酸三磷酸）、反應(yīng)緩沖液、綠色DNA嵌入染料、添加劑和穩(wěn)定劑，以凍干形式提供，用于20微升Z終檢測(cè)體積的PCR級(jí)水。

Bst聚合酶處理方式：

Saphir Bst GreenMaster凍干粉以8管條或96孔板的形式交付，預(yù)裝有完整的主混合物，以干燥、室溫穩(wěn)定的格式。這種凍干粉結(jié)合了高性能與使用的便利性和穩(wěn)定性。無(wú)需進(jìn)行冷凍、解凍或在冰上移液。剩余的少量移液步驟Z小化了錯(cuò)誤或污染的風(fēng)險(xiǎn)。每個(gè)小瓶包含進(jìn)行20微升LAMP（環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增）檢測(cè)所需的所有組分（除了引物和模板）。要執(zhí)行檢測(cè)，只需將小瓶用引物混合物填充并加入DNA模板。這種凍干粉還可以與ROX參照染料一起使用，在兼容ROX信號(hào)評(píng)估的PCR儀器中。在這種情況下，ROX染料（#PCR-351）應(yīng)以1倍濃度添加到PCR反應(yīng)中。

檢測(cè)設(shè)計(jì)：等溫?cái)U(kuò)增是一種極其敏感的檢測(cè)方法，應(yīng)當(dāng)注意避免實(shí)驗(yàn)設(shè)置區(qū)域和設(shè)備與之前反應(yīng)的DNA發(fā)生污染。一個(gè)可能出現(xiàn)的問題是，由于攜帶污染或非特異性退火引物或引物二聚體形成，導(dǎo)致無(wú)模板對(duì)照中出現(xiàn)擴(kuò)增。

引物設(shè)計(jì)：通常，使用4種不同的引物來(lái)識(shí)別6個(gè)不同的DNA區(qū)域，允許特定目標(biāo)基因的擴(kuò)增。額外一對(duì)引物可以進(jìn)一步加速擴(kuò)增，將總檢測(cè)時(shí)間縮短至10-20分鐘。由于反應(yīng)序列復(fù)雜，手動(dòng)設(shè)計(jì)引物可能具有挑戰(zhàn)性。為了簡(jiǎn)化設(shè)計(jì)過(guò)程，建議使用引物設(shè)計(jì)軟件。由于計(jì)算機(jī)設(shè)計(jì)的引物在靈敏度和非模板擴(kuò)增方面可能會(huì)有所不同，建議在Z終選擇之前評(píng)估2-4組真實(shí)引物集。

檢測(cè)設(shè)置：使用無(wú)菌過(guò)濾頭進(jìn)行移液，并在與DNA制備或分析不同的區(qū)域進(jìn)行設(shè)置。所有擴(kuò)增中都應(yīng)包括無(wú)模板對(duì)照。首先，準(zhǔn)備一個(gè)10倍濃度的引物預(yù)混合液。其次，設(shè)置等溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)：

分配主混合物：將引物/探針混合物徹底振蕩（Vortex）以確保均勻性。向每個(gè)PCR管或板孔分配20微升(μl)。

? 使用特定的等溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)儀器或?qū)崟r(shí)PCR循環(huán)儀來(lái)運(yùn)行檢測(cè)。

? 將儀器設(shè)置為在60至65°C之間的恒定孵化溫度（取決于引物退火溫度）。

? 以1分鐘的間隔測(cè)量熒光強(qiáng)度，持續(xù)Z多30分鐘。

故障排除：

如果在無(wú)模板對(duì)照中發(fā)生擴(kuò)增，應(yīng)復(fù)查以下要點(diǎn)：

環(huán)境的交叉污染：

使用“DNA Away”溶液清潔設(shè)備和區(qū)域

用新組分替換試劑庫(kù)存和預(yù)混物

在非模板擴(kuò)增發(fā)生之前提前停止反應(yīng)

來(lái)自先前反應(yīng)產(chǎn)物的攜帶污染：

擴(kuò)增后避免打開反如果需要進(jìn)行反應(yīng)后處理，請(qǐng)使用單獨(dú)的準(zhǔn)備區(qū)域和設(shè)備

引物引起的非模板擴(kuò)增：

逐步將孵化溫度提高1-2°C

為靶序列設(shè)計(jì)一套新的引物