DNA旋轉(zhuǎn)酶是由金黃色葡萄球菌中的兩個(gè)基因GyrA和GyrB編碼的II型拓?fù)洚悩?gòu)酶。DNA旋轉(zhuǎn)酶是一種基本的拓?fù)洚悩?gòu)酶，通過(guò)鏈斷裂/重新連接和DNA纏繞的過(guò)程使DNA超螺旋化。作為一種II型酶，旋轉(zhuǎn)酶在使松弛的質(zhì)粒DNA底物負(fù)超螺旋化方面具有獨(dú)特性。DNA旋轉(zhuǎn)酶也是喹諾酮類(lèi)抗菌劑的靶標(biāo)，這些抗菌劑通過(guò)使酶轉(zhuǎn)變?yōu)镈NA損傷劑來(lái)發(fā)揮作用。TopoGEN提供來(lái)自革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌金黃色葡萄球菌的純化DNA旋轉(zhuǎn)酶，用于藥物開(kāi)發(fā)和篩選測(cè)定的各個(gè)方面。該酶在解鏈和超螺旋化動(dòng)力DNA（kDNA）方面非常活躍，但也會(huì)使松弛的質(zhì)粒DNA負(fù)超螺旋化。金黃色葡萄球菌酶是一個(gè)GyrA2GyrB2的異源四聚體，作為帶有His標(biāo)簽的亞基純化，重新組裝成活性酶。

儲(chǔ)存和運(yùn)輸條件：

該酶應(yīng)儲(chǔ)存在-20°C，并在這種濃縮狀態(tài)下至少穩(wěn)定6個(gè)月。酶可以在首次解凍時(shí)分裝，以最小化多次凍融循環(huán)造成的損害。

單位定義：

一個(gè)單位將在37°C下，在以下描述的條件下，在30分鐘內(nèi)使100 ng的質(zhì)粒超螺旋化。DNA旋轉(zhuǎn)酶也會(huì)像所有II型酶一樣解鏈kDNA；然而，產(chǎn)物將是負(fù)超螺旋化的微型kDNA。

艾美捷TopoGEN金黃色葡萄球菌DNA旋轉(zhuǎn)酶（TG2000GSA）質(zhì)量控制測(cè)試：

1. DNA旋轉(zhuǎn)酶亞基通過(guò)公司專(zhuān)有方法克隆、過(guò)表達(dá)并純化。通過(guò)CB染色在SDS-PAGE上為每個(gè)亞基檢測(cè)到單一帶。通過(guò)在優(yōu)化I型活性的條件下測(cè)試超螺旋DNA的松弛來(lái)評(píng)估拓?fù)洚悩?gòu)酶I的交叉污染。在這些條件下，與超螺旋質(zhì)粒DNA孵育2小時(shí)后，未檢測(cè)到松弛產(chǎn)物。

2. 通過(guò)測(cè)試線性kDNA和線性質(zhì)粒DNA的形成來(lái)進(jìn)行核酸酶污染測(cè)試。在10 mM MgCl2存在下，對(duì)1 ?g的連環(huán)kDNA或超螺旋DNA進(jìn)行孵育（37°C下4小時(shí)）。在這些條件下，未產(chǎn)生線性DNA或分解產(chǎn)物。

3. 根據(jù)SDS-PAGE，亞基純度超過(guò)95%。沒(méi)有另一個(gè)亞基的情況下，任一亞基都不活躍，且任一亞基都不顯示核酸酶活性。這些數(shù)據(jù)表明，宿主（大腸桿菌）不對(duì)金黃色葡萄球菌gyrA或B的單個(gè)亞基的活性有所貢獻(xiàn)。這一點(diǎn)通過(guò)使用特異性針對(duì)大腸桿菌的抗GyrA IgG的Western blotting探針得到了證實(shí)（數(shù)據(jù)未顯示）。

測(cè)定條件：

TopoGEN提供用于測(cè)定金黃色葡萄球菌DNA旋轉(zhuǎn)酶的三種緩沖液樣品。緩沖液如下：

5X測(cè)定液（提供0.5 ml）包含以下溶質(zhì)：

375 mM Tris-HCl（pH 7.5）

37.5 mM MgCl2

37.5 mM DTT

0.375 mg/ml BSA

150 mM KCl

10X ATP液：20 mM ATP（0.25 mL）。酶需要最終濃度為2.0 mM ATP。

5X鉀谷氨酸液：2.5M（0.25 mL）。酶需要最終濃度為500 mM K-Glu。

*注：這些緩沖液提供給客戶，以便為旋轉(zhuǎn)酶測(cè)定建立工作對(duì)照。可能需要額外的緩沖液，建議客戶按照上述配方進(jìn)行補(bǔ)充。

所有緩沖液應(yīng)儲(chǔ)存在-20°C。

TopoGEN金黃色葡萄球菌DNA旋轉(zhuǎn)酶文獻(xiàn)參考：

1. Kato et al. (1990) Cell 63:393-404.

2. Peng, H., and Marians, K. (1999). DNA Topoisomerase Protocols Volume I; page 163

3. Wang, J. (1996) DNA Topoisomerases. Ann. Rev. Biochem 65:635-692

4. Levine et al., (1998) Biochem Biophys Acta 1400:29-43

5. Strahilevitz, J and Hooper, D. (2005) 49:1946-1956

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