拓?fù)洚悩?gòu)酶（topoisomerase）是一類在DNA復(fù)制、重組、轉(zhuǎn)錄和修復(fù)過程中起關(guān)鍵作用的酶。根據(jù)催化功能和氨基酸序列，人的拓?fù)洚悩?gòu)酶主要分為兩類：拓?fù)洚悩?gòu)酶I（Topoisomerase I）和拓?fù)洚悩?gòu)酶II（Topoisomerase II）。拓?fù)洚悩?gòu)酶I通過切割DNA單鏈發(fā)揮作用，而拓?fù)洚悩?gòu)酶II則切割DNA雙鏈。這兩種酶在癌癥治療中具有重要意義，因?yàn)樗鼈冊(cè)谀承┌┘?xì)胞中高表達(dá)，因此成為抗癌藥物的重要靶點(diǎn)。然而，現(xiàn)有的拓?fù)洚悩?gòu)酶抑制劑（如道諾霉素、米托蒽醌、替尼泊苷、依托泊苷、伊立替康和拓?fù)涮婵担╇m然在臨床上用于治療癌癥，但副作用嚴(yán)重，如心臟毒性、免疫系統(tǒng)抑制、震顫和發(fā)熱等。因此，尋找毒性更小的新型拓?fù)洚悩?gòu)酶抑制劑具有重要意義。

貓眼草黃素（Chrysosplenetin）是一種甲氧基黃酮類化合物，廣泛存在于某些菊科植物中，如德國洋甘菊（Chamomilla recutita）和青蒿（Artemisia annua）。它具有多種生物活性，包括抗骨質(zhì)疏松、抗酪氨酸酶和抗神經(jīng)氨酸酶活性，以及抗菌和抗癌作用。特別是，它對(duì)乳腺癌細(xì)胞系（如MCF-7、MDA-MB-231和T47D）具有選擇性抑制作用，而對(duì)正常非腫瘤細(xì)胞（如MRC-5和HUVEC）的毒性較小。”In vitro and in silico assessment of DNA interaction, topoisomerase I and II inhibition properties of （Chrysosplenetin）” 主要研究了天然黃酮類化合物貓眼草黃素與DNA的相互作用及其對(duì)拓?fù)洚悩?gòu)酶I和II的抑制作用。

貓眼草黃素與拓?fù)洚悩?gòu)酶I和拓?fù)洚悩?gòu)酶II共價(jià)DNA復(fù)合物的結(jié)合（A、B）和相互作用（C、D）模式。貓眼草黃素以棒狀圖表示，拓?fù)洚悩?gòu)酶的主鏈以帶狀圖表示，DNA分子則根據(jù)原子的靜電勢(shì)以分子表面渲染，顏色漸變從紅色到白色再到藍(lán)色，其中紅色代表最低的勢(shì)能，藍(lán)色代表最高的勢(shì)能。

實(shí)驗(yàn)方法

材料與試劑：實(shí)驗(yàn)中使用了貓眼草黃素（從青蒿中提取，純度>95%）、pBR322超螺旋質(zhì)粒DNA、人拓?fù)洚悩?gòu)酶I和II（均購自Topogen）、細(xì)胞培養(yǎng)基、MTS細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒等試劑。

細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)：通過MTS法評(píng)估貓眼草黃素對(duì)MCF-7乳腺癌細(xì)胞系的細(xì)胞毒性。將細(xì)胞接種于96孔板中，加入不同濃度的貓眼草黃素孵育72小時(shí)后，測(cè)定細(xì)胞增殖情況。

DNA水解切割實(shí)驗(yàn)：使用瓊脂糖凝膠電泳評(píng)估貓眼草黃素對(duì)pBR322超螺旋質(zhì)粒DNA的水解切割作用。將DNA與不同濃度的貓眼草黃素孵育后，觀察DNA形態(tài)的變化。

DNA保護(hù)實(shí)驗(yàn)：通過Fenton反應(yīng)產(chǎn)生羥基自由基，評(píng)估貓眼草黃素對(duì)pBR322超螺旋質(zhì)粒DNA的氧化損傷保護(hù)作用。將DNA與Fenton試劑及不同濃度的貓眼草黃素孵育后，觀察DNA形態(tài)的變化。

拓?fù)洚悩?gòu)酶抑制實(shí)驗(yàn)：使用瓊脂糖凝膠電泳評(píng)估貓眼草黃素對(duì)拓?fù)洚悩?gòu)酶I和II的抑制作用。將超螺旋pBR322質(zhì)粒DNA與拓?fù)洚悩?gòu)酶及不同濃度的貓眼草黃素孵育后，觀察DNA形態(tài)的變化。

分子對(duì)接研究：使用AutoDockTools和MacroModel軟件進(jìn)行分子對(duì)接研究，評(píng)估貓眼草黃素與DNA及拓?fù)洚悩?gòu)酶I和II的結(jié)合模式和親和力。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果

細(xì)胞毒性：貓眼草黃素對(duì)MCF-7細(xì)胞具有顯著的細(xì)胞毒性，IC50值為0.29μM。這與先前的研究結(jié)果一致，表明貓眼草黃素對(duì)乳腺癌細(xì)胞具有顯著的抑制作用。

DNA水解切割：在不同濃度的貓眼草黃素作用下，pBR322超螺旋質(zhì)粒DNA的形態(tài)未發(fā)生變化，表明貓眼草黃素未引起DNA的水解切割。

DNA保護(hù)：貓眼草黃素以濃度依賴的方式顯著保護(hù)了pBR322超螺旋質(zhì)粒DNA免受Fenton反應(yīng)產(chǎn)生的羥基自由基的損傷。這表明貓眼草黃素具有抗氧化和DNA保護(hù)作用。

拓?fù)洚悩?gòu)酶抑制：貓眼草黃素對(duì)拓?fù)洚悩?gòu)酶I和II均表現(xiàn)出顯著的抑制作用。特別是在12.5-100μM濃度范圍內(nèi)，對(duì)拓?fù)洚悩?gòu)酶II的抑制率達(dá)到了83-96%。這表明貓眼草黃素可能通過抑制拓?fù)洚悩?gòu)酶的活性來發(fā)揮其抗癌作用。

分子對(duì)接研究：分子對(duì)接研究表明，貓眼草黃素能夠通過插入或溝槽結(jié)合的方式與DNA結(jié)合，并通過與拓?fù)洚悩?gòu)酶I和II的活性位點(diǎn)結(jié)合來抑制其活性。這些結(jié)果進(jìn)一步支持了貓眼草黃素作為潛在抗癌藥物的潛力。

貓眼草黃素對(duì)拓?fù)洚悩?gòu)酶I的抑制作用。1:DNA對(duì)照；2: DNA + 1u拓?fù)洚悩?gòu)酶；3-6:DNA + 1u拓?fù)洚悩?gòu)酶I +黃銅礦素（12.5, 25, 50, 100 μm）。	貓眼草黃素對(duì)拓?fù)洚悩?gòu)酶II的抑制作用。1:DNA對(duì)照；2: DNA + 1u拓?fù)洚悩?gòu)酶；3-6:DNA + 1u拓?fù)洚悩?gòu)酶II +黃銅礦素（12.5, 25, 50, 100 μm）。

Topogen品牌的人拓?fù)洚悩?gòu)酶I和II在藥物研發(fā)領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用價(jià)值。它們不僅可用于篩選和評(píng)估新型抗癌藥物的拓?fù)洚悩?gòu)酶抑制活性，還可用于研究拓?fù)洚悩?gòu)酶的結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系，以及探索新型抗癌藥物的作用機(jī)制。此外，這些酶還可用于建立高效的藥物篩選平臺(tái)，加速抗癌藥物的研發(fā)進(jìn)程。