艾美捷科技，Cell Biolabs中國(guó)區(qū)總代理  

*為方便客戶使用試劑盒，艾美捷科技善意將其翻譯成中文操作手冊(cè)，請(qǐng)以試劑盒中配套的英文版為準(zhǔn)。因編者翻譯水平有限，對(duì)于由本說(shuō)明書(shū)中不當(dāng)翻譯所造成的損失，概不負(fù)責(zé)，如有錯(cuò)誤，歡迎指正！

本說(shuō)明書(shū)對(duì)應(yīng)英文鏈接：https://www.cellbiolabs.com/sites/default/files/STA-350-comet-assay-kit.pdf

實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前，建議先通讀說(shuō)明書(shū)（請(qǐng)以試劑盒中配套的英文版為準(zhǔn)）：

      介紹：由于環(huán)境因素和細(xì)胞內(nèi)正常的新陳代謝過(guò)程，DNA損傷每天以每個(gè)細(xì)胞1000到100萬(wàn)個(gè)分子損傷的速度發(fā)生。雖然這只占人類基因組約60億個(gè)堿基(30億個(gè)堿基對(duì))的一小部分，但關(guān)鍵基因的未修復(fù)損傷可能會(huì)阻礙細(xì)胞發(fā)揮其功能的能力，并顯著增加癌癥的可能性。彗星實(shí)驗(yàn)（Comet assay）也被稱為單細(xì)胞凝膠電泳實(shí)驗(yàn)（Single cell gel electrophoresis，SCGE），是一種超靈敏的單細(xì)胞水平上檢測(cè)DNA損傷的技術(shù)。在電泳場(chǎng)下，損傷的細(xì)胞DNA(包含碎片和鏈斷裂)從完整的DNA中分離出來(lái)，在顯微鏡下形成典型的“彗星尾巴”形狀。DNA損傷的程度通常是通過(guò)測(cè)量彗星尾巴來(lái)目測(cè)的，也可以使用圖像分析軟件來(lái)測(cè)量各種參數(shù)。

OxiSelect™ Comet Assay是一種快速、靈敏的，用于測(cè)量細(xì)胞DNA損傷的試劑盒。每個(gè)試劑盒提供足夠的試劑，最多可進(jìn)行15次檢測(cè)。

OxiSelect™ Comet Assay實(shí)驗(yàn)原理：Cell Biolabs 的 OxiSelect™ Comet Assay 是一種單細(xì)胞凝膠電泳法 (SCGE)，用于簡(jiǎn)單評(píng)估細(xì)胞 DNA 損傷。首先，將單個(gè)細(xì)胞與低熔點(diǎn)瓊脂混合后，再應(yīng)用到OxiSelect™ Comet特制玻片上。然后，用裂解緩沖液和堿性溶液處理這些嵌入的細(xì)胞，使DNA松弛并變性。最后，在電泳槽中對(duì)進(jìn)行電泳，以分離完整的DNA和受損的片段。電泳后，樣品被干燥，用DNA染料染色，并通過(guò)外顯熒光顯微鏡可視化。在這些條件下，受損的DNA（包含裂解和鏈斷裂）將比完整的DNA遷移更多，并產(chǎn)生 "彗星尾 "形狀（見(jiàn)圖1）。

圖1，彗星實(shí)驗(yàn)原理與流程示意圖

客戶自備材料：

1.氯化鈉粉末

2.NaOH顆粒

3.10 N NaOH，用于調(diào)整pH值 （10 N NaOH = 10 M NaOH =10 mol/L NaOH）

4.DMSO（可選）

5.70%乙醇

6.TE緩沖液（10mM Tris，pH 7.5，1mM EDTA）。

7.PBS（不含Mg2+和Ca2+）。

8.EDTA(二鈉鹽)

9.DI H2O（去離子水）

10.37ºC和沸水浴

11.水平電泳槽

12.可調(diào)節(jié)的單通道微量移液器，帶一次性吸頭。

13.帶FITC過(guò)濾器的外顯熒光顯微鏡

保存條件：收到試劑盒后，將綠色熒光DNA染料，10000X存放在-20ºC。 所有其他試劑盒組件在室溫下儲(chǔ)存。

一、試劑準(zhǔn)備：

1.OxiSelect™ CometAgarose：將Comet Agarose瓶放在90-95ºC水浴中加熱20分鐘，或者直到瓊脂膠液化。將瓶子轉(zhuǎn)移到37℃的水浴中20分鐘，并保持直到使用。

2.1X Vista Green DNA Dye工作液:使用TE緩沖液（10 mM Tris, pH 7.5, 1 mM EDTA）稀釋原10000X的Vista Green DNA Dye母液，按照1:10000的比例，稀釋成1X的Vista Green DNA Dye工作液。1X工作液可在4℃避光條件下保存3周。

3.Lysis Buffer: 準(zhǔn)備100ml的1X 裂解緩沖液

* 血紅素在4℃成膠狀，用DMSO溶解的血紅素。DMSO的添加是任選的，僅對(duì)含有血紅素的樣品（例如血細(xì)胞或組織樣品）是必需的。加入DMSO對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果沒(méi)有影響。

4.Alkaline Solution：準(zhǔn)備100ml的堿性溶液

5.Electrophoresis Running Solution: 準(zhǔn)備1L電泳緩沖液，需求選擇電泳模式（二選一）：

* 實(shí)驗(yàn)過(guò)程中的各類緩沖液都需要4℃預(yù)冷。

5.1 TBE Electrophoresis Solution （中性）

或者5.2 Alkaline Electrophoresis Solution (300 mM NaOH, pH >13, 1 mM EDTA)（堿性）

特殊說(shuō)明：為避免紫外線對(duì)細(xì)胞樣品造成額外損害，請(qǐng)?jiān)谌豕鈼l件下進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

二、準(zhǔn)備樣品和玻片：

1.準(zhǔn)備裂解緩沖液、堿性溶液和電泳緩沖液（見(jiàn)試劑準(zhǔn)備），然后再進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。將所有溶液徹底冷卻至4ºC。

2.將OxiSelect™ Comet Agarose放在90-95ºC水浴中加熱20分鐘，或者直到瓊脂膠液化。將瓶子轉(zhuǎn)移到37℃的水浴中20分鐘進(jìn)行冷卻，并保持直到使用。

3.在OxiSelect™ Comet玻片上，每孔加入75 ul 37℃的Comet Agarose，形成基層膠。用移液器將膠溶液涂抹在孔上，確保完全覆蓋和平鋪。將載玻片轉(zhuǎn)移到4ºC下水平放置15分鐘，使其固化。

4.按照如下方式準(zhǔn)備細(xì)胞樣品，與對(duì)照細(xì)胞：

懸浮細(xì)胞：以700×g離心2mins，棄上清，用冰冷的PBS（無(wú)Mg2+和Ca2+）洗滌細(xì)胞一次，離心，棄上清。最后，用預(yù)冷4℃的PBS（無(wú)Mg2 +和Ca 2 +）重懸細(xì)胞到1×10⁵個(gè)細(xì)胞/ml 。

貼壁細(xì)胞：輕輕地從細(xì)胞培養(yǎng)瓶/培養(yǎng)皿中取出細(xì)胞，用橡膠細(xì)胞刮處理。將細(xì)胞懸浮液轉(zhuǎn)移到錐形管（EP）中，并在700×g離心2mins，棄上清。用冰冷的PBS（不含Mg2+和Ca2+）洗滌細(xì)胞一次，離心，并丟棄上清液。最后，用預(yù)冷4℃的PBS（無(wú)Mg2 +和Ca 2 +）重懸細(xì)胞到1×10⁵個(gè)細(xì)胞/ml 。

組織樣品：使用解剖剪刀，切碎一小塊組織到1-2ml冰冷的含20mM EDTA的PBS緩沖液（無(wú)Mg2 +和Ca 2 +）。組織/細(xì)胞懸浮液放置5分鐘，然后將上清液轉(zhuǎn)移到離心管中，避免轉(zhuǎn)移碎片。700×g離心2mins，丟棄上清液。最后，用預(yù)冷4℃的PBS（無(wú)Mg2 +和Ca 2 +）重懸細(xì)胞到1×10⁵個(gè)細(xì)胞/ml 。

* 推薦陽(yáng)性對(duì)照：使用20 uM Etoposide（依托泊苷）處理4小時(shí)。

5.將細(xì)胞懸液與Comet Agarose（步驟2）以1:10的比例（v/v），用移液槍混合均勻，并立即轉(zhuǎn)移75ul 到每個(gè)孔中的原基層膠上方（步驟3）。確保完全覆蓋平鋪孔板，非常輕柔和小心地用移液管尖傳播的懸浮液，而不干擾基層膠。

Note: 對(duì)于多個(gè)樣品的處理，將細(xì)胞與Comet Agarose混合液保持在37℃，避免凝膠化。準(zhǔn)備好樣品后，重新混勻，依次取出75ul加入到玻片孔中。

作為一家具有高端的技術(shù)實(shí)力、先進(jìn)的經(jīng)營(yíng)管理水平和完善的市場(chǎng)銷售體系的生物高科技企業(yè)，總部位于武漢光谷高新技術(shù)開(kāi)發(fā)區(qū)，服務(wù)面向全國(guó)。艾美捷科技是集進(jìn)口試劑、實(shí)驗(yàn)室耗材銷售、技術(shù)服務(wù)與合約開(kāi)發(fā)為一體的專業(yè)化高科技公司，為用戶提供專業(yè)的前沿資訊、完備的產(chǎn)品、整合的解決方案，及優(yōu)質(zhì)的物流服務(wù)。為了更好的服務(wù)客戶，公司組建了一支經(jīng)驗(yàn)豐富的研發(fā)團(tuán)隊(duì)-艾美捷生物技術(shù)中心，進(jìn)入研發(fā)生產(chǎn)階段，將更優(yōu)質(zhì)的產(chǎn)品推薦給國(guó)內(nèi)生物領(lǐng)域的同仁們!