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儲存：凍干粉原裝儲存在 2-8℃（不開封原裝保存 3-5 年）。

溶解：加入一定體積 dH2O（參考特定說明書），溶解完全。工作液現(xiàn)用現(xiàn)配。

保存：

（短期保存）未稀釋的液體，在 2-8℃下穩(wěn)定約 6 周；

（長期保存）

方法一、水化后分裝，置于-70°C 或以下冷凍保存，避免重復凍融。

方法二、添加等體積的甘油(ACS 級或更高)，終濃度變?yōu)樵瓉淼?50%，以液體形式儲存于-20℃。

注意：加入甘油后使蛋白質(zhì)濃度和稀釋的范圍都減半（比如：重溶后抗體的濃度是 0.8mg/ml，

體積 2ml，抗體稀釋比例 1:5,000 - 1:100,000 for WB, 加入等體積（2ml）的甘油后, 抗體濃

度變成 0.4mg/ml，體積 4ml,抗體稀釋比例變成 1:2500-1:50000 for WB）。

水化后保質(zhì)期：自補水之日起一年。如果測試結(jié)果符合預期用途，則可以延長有效期

我們知道，ProSpec 相當一部分細胞因子和蛋白為凍干粉，這使得運輸非常便捷，只要常溫即可。而且，細胞因子和蛋白 凍干粉非常穩(wěn)定，在-20℃或-80℃條件下可保存數(shù)年。凍干粉在使用前需進行溶解，然后以液體形式加到培養(yǎng)體系。溶解步驟非 常關(guān)鍵，因溶解不好會導致細胞因子或蛋白的失活，這也是很多用戶在實際使用中經(jīng)常遇到的問題。

那么，應該如何進行正確的溶解呢？ 

下面我們以 Recombinant Human IL-4 (重組人 IL-4，產(chǎn)品編號：CYT-211)的說明書為例，對細胞因子或蛋白的溶解方法 進行詳細的闡述。 

拿到重組人 IL-4 的說明書后，您會發(fā)現(xiàn)有一段關(guān)于 Reconstitution(重懸)的敘述，這段內(nèi)容含有溶解相關(guān)的所有信息。

1. Centrifuge the vial prior to opening  

第 1 步：開蓋前離心試劑管 

ProSpec 的細胞因子或蛋白凍干粉裝盛在塑料管中，為無菌包裝。凍干粉在運輸過程中可能會因顛簸而漂散并粘貼于管壁 或管蓋上，所以在打開塑料瓶蓋前，需將凍干粉通過離心收集到管底，以便用很小體積的液體即可將凍干粉完全溶解。 

有很多用戶會問一個問題，即應該用多少轉(zhuǎn)速、多長時間離心試劑管，才能達到良好的收集效果？ 

答：有些小型高速離心機(多為進口品牌)的面板上有一個 Spin 鍵，按了此鍵后，離心機會自動快速上升到其最大速度 (10000rpm 或 12000rpm)，上升到最高點后速度即刻下降，直至停止旋轉(zhuǎn)，整個過程大約 30s。這個 Spin 鍵足以很好的將細 胞因子或蛋白收集到管底。但有些實驗室沒有這樣的高速離心機，只有最高轉(zhuǎn)速為 4000-4500rpm 的離心機。這種情況下，需 3000-3500rpm 離心 5min，也能達到類似的效果。

2. Reconstitute in water to a concentration of 0.1-1.0 mg/ml. Do notvortex. 

第 2 步：用無菌水重懸至 0.1-1.0 mg/ml，不可振蕩。 

這個步驟即為溶解步驟，非常重要。 

1) 一定要用推薦的溶液重懸(或溶解)凍干粉 

用于溶解細胞因子或蛋白的溶液千差萬別。此例中的重組人 IL-4 需用水溶解，而重組人 IL-2 (產(chǎn)品編號：CYT-209)則需用 20mM Acetic Acid (醋酸)溶解，重組人 TGF-beta1(產(chǎn)品編號：CYT-716）需用 10mMAcetic Acid (醋酸)溶解 (注：即使同一 重組細胞因子或蛋白，不同批次的溶解方法也可能有所不同，因此上面的敘述僅供參考。具體應該如何溶解應以相應批次的官方 說明書為準)。后續(xù)的文章中將對各種溶解液的配制方法進行詳細的闡述，望繼續(xù)關(guān)注。 

經(jīng)常有用戶會問，為什么會有這么多種溶解方法？ 

答：我們知道，蛋白的溶解性與很多因素有關(guān)，其中比較重要的是 pH 值和離子強度。ProSpec 的細胞因子或重組蛋白在 出廠前均經(jīng)嚴格測試，說明上所標明的溶解液是能夠?qū)⒃摷毎蜃踊蛑亟M蛋白完全溶解的液體。如果您所用的溶解液的 pH 值和 離子強度與說明書中所標明的不符，很多時候會造成細胞因子或重組蛋白不能完全溶解或者根本無法溶解，這樣所配得的細胞因 子或重組蛋白必然活性不夠或喪失。 

有不少用戶沒注意說明書上的描述，而是根據(jù)習慣，直接用 PBS 或培養(yǎng)液(1640 或 DMEM 等)等溶解細胞因子或蛋白的 凍干粉。這樣做可以嗎？

答：有時可以，要看具體情況。ProSpec 的大多數(shù)細胞因子或蛋白凍干粉的溶解液不是 PBS，此時千萬不能用 PBS 或培 養(yǎng)液直接來溶解，具體原因在上面已經(jīng)敘述過。而有部分細胞因子，如重組人 KGF 和重組人 FGF-23 等，說明書上的溶解液即為 1x PBS，此時用 PBS 溶解完全沒問題，那么用培養(yǎng)液溶解也是可以的，不過最好還是用先用 PBS 溶解，然后再用培養(yǎng)液稀釋。 

2) 一定要溶解到指定的濃度。 蛋白在一定的濃度范圍內(nèi)可以保持良好的穩(wěn)定性，這個范圍就是說明書上所標明的濃度范圍，該例為 0.1-1.0mg/ml。 這個濃度范圍對于不同的細胞因子或重組蛋白是不同的。 

高于或低于該濃度范圍會有什么問題呢？ 

答：首先，細胞因子或蛋白會不穩(wěn)定，即很容易出現(xiàn)活性下降的現(xiàn)象。其次，高于這個濃度范圍，可能會超過該蛋白的 最大溶解濃度，即蛋白無法完全溶解。再者，高于或低于該濃度范圍，蛋白可能會出現(xiàn)聚集(aggregation)，最終結(jié)果還是部分 蛋白未溶解，導致蛋白活性的減弱。 

3) 一定不能振蕩(vortex)。 

這里所說的振蕩是指用渦旋儀進行快速振蕩。 

有用戶會問，若想保證溶解液與凍干粉充分混勻，以實現(xiàn)細胞因子或重組蛋白的完全溶解，該怎么辦呢？

答：多數(shù)細胞因子或重組蛋白的凍干粉是非常容易溶解的，一般我們用移液槍的槍頭輕吹幾下，即可使細胞因子或重組 蛋白完全溶解。 

對于不易溶解的細胞因子或蛋白，ProSpec 會在說明書中進行備注。這種情況下，您最好能將要溶解的細胞因子或重組 蛋白放在水平搖床(shaker)上低速搖一段時間，促使細胞因子或重組蛋白完全溶解。 

3. This solution can be stored at 2-8℃ for up to 1week. 

第 3 步：該重懸液在 2-8℃最長可保存 1 周。 

用說明書上推薦的溶液將細胞因子或重組蛋白重懸到推薦的濃度后，細胞因子或重組蛋白可放置在 2-8℃，即冰箱的冷藏室。 在這種條件下，細胞因子或重組蛋白的活性最長可保持 1 周。這對一個周期為 5-7 天的實驗，如 DC(樹突狀細胞)的誘導成熟是 足夠的。在此期間，只要每次從冰箱里吸取一定量的細胞因子或重組蛋白溶液加入到培養(yǎng)體系內(nèi)即可。 

其實，說明書上推薦的濃度對于一般的實驗來講是比較高的。所以用戶通常會將該溶液進一步稀釋后再放在 4℃保存，待 1 周內(nèi)用完。如進行稀釋，必須遵照下面第 4 步的方法，即需用含載體蛋白的溶液進行稀釋，否則稀釋后的細胞因子或重組蛋白很 容易會粘附在管壁或瓶壁上，使得溶液中的細胞因子或重組蛋白的濃度下降，細胞因子或重組蛋白的總活性則大為減弱。

4. For extended storage, it is recommended to further dilute in abuffer containing a carrier protein (example 0.1%  BSA) and store in workingaliquots at -20℃ to -80℃. 

第 4 步：如要長期保存，則需用含載體蛋白(如 0.1% BSA，或 10% FBS，或 5% HSA)的溶液進一步稀釋，然后分裝凍存于-20℃ 至-80℃。 

如果一個實驗周期長于一周，或配制的細胞因子或重組蛋白一次用不完，我們就需對細胞因子或重組蛋白進行長期保存。 方法是：將已重懸的細胞因子或蛋白用含載體蛋白，如 0.1%BSA(牛血清白蛋白)，10% FBS(胎牛血清)，5% HSA(人血清白蛋白) 的溶液將重懸液進一步稀釋，然后分裝凍存于-20℃至-80℃，即常規(guī)冰箱的冷凍室或超低溫冰箱中。 

經(jīng)常有人會在細胞因子或重組蛋白凍干粉用推薦的溶液重懸后直接分裝凍存于-20℃至-80℃，這樣可以嗎？ 

答：不行。我們知道，塑料管壁對多數(shù)蛋白均有很好的吸附作用，也就是說溶液中的蛋白很容易粘附在管壁。粘附后， 蛋白是很難與管壁分離的。做過 ELISA 實驗的人都知道，ELISA 的包被抗體(Capture antibody)就是通過這種粘附作用包被到酶 標板上的。 

載體蛋白，如 1% BSA，10% FBS(胎牛血清)和 5% HSA 等的主要作用是預先封閉塑料管壁上的蛋白結(jié)合位點，使細胞因子 或重組蛋白不會粘附于管壁。如果在細胞因子或重組蛋白凍干粉用推薦的溶液重懸后不用含載體蛋白的溶液進一步稀釋，而直接 分裝凍存，則溶液中的大部分細胞因子或重組蛋白均會粘附到管壁上，導致溶液中實際溶解的細胞因子或重組蛋白的濃度大為降 低，最終表現(xiàn)為細胞因子或重組蛋白活性的下降。 

因此，在分裝凍存前，一定要用含載體蛋白的溶液將重懸液進一步稀釋。稀釋后的細胞因子或重組蛋白可為任意濃度，因大 量的載體蛋白可以保證低濃度細胞因子或重組蛋白仍然維持較高的穩(wěn)定性。 

那么，含載體蛋白的溶液指的是什么溶液呢？水可以嗎？ 

答：水不可。該溶液通常是指 pH 近中性，有一定緩沖能力的緩沖液，如 PBS，培養(yǎng)液(RPMI1640, DMEM 等)等。 

還有一個經(jīng)常被問及的問題，即在做無血清培養(yǎng)或動物的體內(nèi)實驗時，細胞因子中不能含有 BSA，F(xiàn)BS 或 HSA 等動物或 人的蛋白，要想長期保存細胞因子或重組蛋白該怎么辦呢？ 

答：一種方法是訂購 ProSpec 的小包裝細胞因子或重組蛋白，每次使用一只，用后即廢棄。

5. 后續(xù)稀釋液的配方：即原產(chǎn)品的溶液的配方。 

總之，為保證細胞因子或重組蛋白凍干份在重懸后仍能保持良好的生物活性，必須按照說明書中 Reconstitution 的方法 嚴格操作。 

蛋白有價，實驗無價，愿大家珍惜每次實驗機會，嚴謹認真，每次均能得到預期的實驗結(jié)果！

1) 除少數(shù)例外，大多數(shù)人類細胞因子對小鼠細胞均有活性。

2) 許多小鼠細胞因子也可作用于人類細胞，但比活性可能低 于對應的人類細胞因子。 

3) IL-7 等為數(shù)不多的人類細胞因子作用于小鼠細胞時比對應的小鼠細胞因子活性更強。

4) 干擾素， GM-CSF, IL-3 和 IL-4 等細胞因子種屬特異，對非同源細胞幾乎沒有活性。

5) 相反，成纖維細胞生長因子(FGFs)和神經(jīng)營養(yǎng)素 (neurotrophins)高度保守，在不同動物種屬細胞上均具有很好的活性。

ED50 為半數(shù)有效濃度，其定義是可誘導 50%最大反應的細胞因子濃度，這種活性表示法僅適用于劑量反應曲線呈 S 形 的細胞因子。其實，可以將 ED50 的值接理解為 1unit。如某種細胞因子或蛋白的 ED50 為 1ng/ml，那么 1ng/ml 即可看作是 1unit。 那么我們也不難理解，1mg(1x106ng) 該細胞因子或蛋白中應含 1x106/1= 106units. ED50(ng/ml)轉(zhuǎn)化為 units/mg 的公式如下：

與市場上的許多蛋白產(chǎn)品不同，ProSpec 的產(chǎn)品中均不含載體蛋白或其它添加物(如牛血清白蛋白(BSA)，人血清白蛋白 (HSA)和蔗糖等，并且是以最低含鹽量的溶液進行凍干的，因此凍干后常常不能形成白色網(wǎng)架結(jié)構(gòu)，而是微量的蛋白在凍干過程 中沉積在管內(nèi)，形成很薄或肉眼不可見的透明蛋白層。打開管蓋前，我們建議您在小離心機中快速離心 20-30 秒，使附著在管蓋 或管壁上的蛋白聚集于管底。我們的質(zhì)控步驟保證每管中所含的蛋白量準確無誤，雖然有時您無法看到蛋白粉末，但管中的蛋白 含量仍是非常精確的。

除非在產(chǎn)品說明書中特別注明，ProSpec 相當一部分產(chǎn)品為凍干粉，它們在室溫條件下非常穩(wěn)定(至少 1 個月)。盡管如 此，我們還是建議您在收到我們的產(chǎn)品后保存于-20℃，以確保蛋白 100%的活性。對于大多數(shù)蛋白，重懸后在 4℃僅能短期保存 (約 1 周)。如想長期保存，請先配制成稀釋液(其中必須含有載體蛋白，如 0.1% BSA，5%HSA，或 10% FBS)，然后分裝凍存于 -20℃或-80℃。一定要避免反復凍融，因每次凍融均會引起蛋白的部分失活。

1.找到這個抗體的免疫原，什么蛋白的抗體。【留意應用類型和反應種屬】 或者，在【靶標】這一欄觀察，SwissProt 這一欄，至于是選人的還是小鼠的， 根據(jù)客戶實驗需求來。可以點擊進去，進入 Uniprot 數(shù)據(jù)庫。

2. (Uniprot ID: P25054).這是數(shù)據(jù)庫的 ID，類似身份證，打開數(shù)據(jù)庫：http://www.uniprot.org/ ，輸入 ID，P25054，搜索。

3.

全名如圖，可以用全名和縮寫去搜索抗體。并在其它品牌的產(chǎn)品頁面，留意觀 察抗原的信息，是否與數(shù)據(jù)庫的一致 ···這個 ID 相同，就像身份證號碼一樣，指示是同一個人。 

案例：（問題，是否為同一個蛋白，是否可以替換為 Abbkine 產(chǎn)品） 

1. http://www.alomone.com/p/anti-angiotensin-(1-7)_mas_receptor/agp-099/119 

2. http://www.abbkine.com/product/mas1-polyclonal-antibody-abp57206/

●膜上多處出現(xiàn)黑點或黑斑原因：抗體與封閉試劑發(fā)生非特異性的結(jié)合。 

●反白（條帶顯白色）原因：目的蛋白含量太高或者一抗?jié)舛绕摺?nbsp;

●蛋白分子量偏低或偏高原因：膠濃度不適合，高分子量要用低濃度膠；小分子蛋白要用高濃度膠。

可能的原因及建議： 

●檢測樣本不表達目的蛋白選擇表達量高的細胞作為陽性對照，用于確定檢測樣本是否為陰性。 

●檢測樣本低表達目的蛋白提高上樣量，裂解液中注意加入蛋白酶抑制劑。 

●轉(zhuǎn)移不完全或過轉(zhuǎn)移可以用麗春紅染膜并結(jié)合染膠（考馬斯亮藍）后確定條帶是否轉(zhuǎn)至膜上或轉(zhuǎn)移過 頭；適當調(diào)整轉(zhuǎn)膜的時間和電流。 

●抗體不能識別測試種屬的相關(guān)蛋白購買抗體前應當認真閱讀抗體說明書，確定其是否能夠交叉識別測 試種屬的對應蛋白。 

●一抗孵育時間不足建議 4℃結(jié)合過夜。 

●二抗與一抗不匹配 選擇針對一抗來源的種屬的抗體。 

●洗膜過度洗膜時間不宜過長，加入的去垢劑不宜過強或過多，建議使用0.1%的弱去垢劑 Tween-20。

操作有毒試劑時，帶手套和口罩，且操作揮發(fā)性試劑應在通風櫥中進行。

可能的原因及建議： 

●目的蛋白有多個修飾位點（磷酸化位點、糖基化位點、乙酰化位點等），本身可以呈現(xiàn)多條 帶。查閱文獻或進行生物信息學分析，獲得蛋白序列的修飾位點信息，通過去修飾確定蛋白實際大小。

●目的蛋白有其它剪切本查閱文獻或生物信息學分析可能性。 

●樣本處理過程中目的蛋白發(fā)生降解加入蛋白 酶抑制劑；樣本處理時在冰上操作。 

●上樣量過高，太敏感適當減少上樣量。 

●一抗特異性不高重新選擇或制備 高特異性的抗體。 

●一抗不純純化抗體 

●一抗或者二抗?jié)舛绕呓档涂贵w濃度。

●︶條帶呈笑臉狀 原因：凝膠不均勻冷卻，中間冷卻不好;電泳系統(tǒng)溫度偏高。 

●︵條帶呈皺眉狀原因：可能是由于裝置不合適，特別可能是凝膠和玻璃擋板底部有氣泡，或者兩邊聚 合不完全。 

●拖尾原因：樣品溶解不好。 

●紋理（縱向條紋）原因：樣品中含有不溶性顆粒。 

●條帶偏斜原因：電極不平衡或者加樣 位置偏斜。

●條帶兩邊擴散原因：加樣量過多。