解析文章《Real-Time Assessment of Tissue Hypoxia In Vivo with Combined Photoacoustics and High-Frequency Ultrasound》

作者：

Marco Gerling ^1* , Ying Zhao ^2,3* , Salvatore Nania ³ , K. Jessica Norberg ³ , Caroline S. Verbeke ⁴ , Benjamin Englert ¹ , Raoul V. Kuiper ⁶ , ?sa Bergstr?m ¹ , Moustapha Hassan ⁵ , Albrecht Neesse ⁷ , J. Matthias L?hr ^1,3 , Rainer L. Heuchel ^1,3 *

鏈接：

https://pmc.ncbi.nlm.nih.gov/articles/PMC3982131/

背景

在癌癥研究中，非侵入性功能成像已成為評(píng)估腫瘤發(fā)展和治療效果的重要工具。腫瘤缺氧與腫瘤的侵襲性和預(yù)后密切相關(guān)，是監(jiān)測(cè)癌癥進(jìn)展的關(guān)鍵參數(shù)之一。近年來，光聲（Photoacoustic, PA）成像技術(shù)因其能夠結(jié)合高頻率超聲（Ultrasound, US）實(shí)現(xiàn)解剖學(xué)和功能性信息的并行收集，逐漸在臨床前研究中展現(xiàn)出應(yīng)用潛力。光聲成像通過激光脈沖激發(fā)分子產(chǎn)生熱彈性波，這些波可以被超聲接收器檢測(cè)，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)深層組織內(nèi)光吸收分子的高分辨率成像。

方法

實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

本研究采用了一種新型的雙模態(tài)PA/US系統(tǒng)，旨在測(cè)試雙波長(zhǎng)PA測(cè)量相對(duì)組織氧合度的可行性和可靠性。研究團(tuán)隊(duì)在小鼠胰腺癌和結(jié)腸癌模型上進(jìn)行了成像，并將組織氧合度的差異與相應(yīng)組織區(qū)域的免疫組化缺氧染色進(jìn)行了比較。

Hypoxyprobe? Omni Kit 試劑盒的應(yīng)用

在實(shí)驗(yàn)中，為了可視化缺氧區(qū)域，研究團(tuán)隊(duì)使用了Hypoxyprobe?-1 Omni試劑盒（Hypoxyprobe Inc.生產(chǎn)，貨號(hào)：HP3）。該試劑盒包含Pimonidazole HCl和親和純化的兔抗Pimonidazole抗體（PAb2627AP）。Pimonidazole是一種乏氧細(xì)胞標(biāo)記物，能夠在缺氧條件下與細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)結(jié)合，形成穩(wěn)定的加合物。通過腹腔注射Pimonidazole后，可以使用PAb2627AP抗體進(jìn)行免疫組化染色，從而可視化組織中的缺氧區(qū)域。

具體實(shí)驗(yàn)步驟

腫瘤模型建立：研究團(tuán)隊(duì)使用了小鼠胰腺癌（KPC細(xì)胞系）和結(jié)腸癌（通過AOM和DSS誘導(dǎo)）模型。

成像與數(shù)據(jù)采集：使用VisualSonics Vevo 2100 LAZR成像系統(tǒng)對(duì)小鼠進(jìn)行PA和B模式US成像。在PA成像中，采用750 nm和850 nm的雙波長(zhǎng)激光脈沖，測(cè)量氧合血紅蛋白（HbO?）和脫氧血紅蛋白（Hb）的濃度，進(jìn)而計(jì)算組織氧飽和度（sO?）。在成像前，通過腹腔注射Pimonidazole，隨后在成像后進(jìn)行免疫組化分析，以驗(yàn)證PA成像結(jié)果的準(zhǔn)確性。

免疫組化分析：切除腫瘤組織，用4%甲醛固定過夜，并進(jìn)行石蠟包埋切片。

使用PAb2627AP抗體進(jìn)行免疫組化染色，檢測(cè)Pimonidazole與缺氧細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的加合物。使用ImageJ軟件量化棕色染色強(qiáng)度，以評(píng)估缺氧程度。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果

實(shí)時(shí)光聲成像檢測(cè)小鼠器官氧合度變化

通過改變小鼠的氧氣供應(yīng)，研究團(tuán)隊(duì)證明了PA系統(tǒng)能夠?qū)崟r(shí)檢測(cè)組織氧合度的變化。當(dāng)氧氣供應(yīng)從醫(yī)用空氣（21% O?）增加到純氧（100% O?）時(shí)，PA成像顯示肝臟實(shí)質(zhì)和胃壁的氧合度均有所增加，且肝臟實(shí)質(zhì)的氧合度增加更為迅速和顯著。當(dāng)氧氣供應(yīng)恢復(fù)到醫(yī)用空氣時(shí)，氧合度也隨之恢復(fù)正常。

腫瘤缺氧檢測(cè)及與組織學(xué)評(píng)估的相關(guān)性

在胰腺癌和結(jié)腸癌模型中，PA成像能夠準(zhǔn)確識(shí)別缺氧區(qū)域，并與免疫組化染色結(jié)果高度一致。例如，在胰腺癌模型中，PA成像能夠清晰顯示腫瘤內(nèi)的缺氧區(qū)域，而免疫組化染色也證實(shí)了這些區(qū)域的缺氧狀態(tài)。通過線性回歸分析，研究團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)PA測(cè)量的氧飽和度與Pimonidazole染色強(qiáng)度之間存在顯著的正相關(guān)關(guān)系（r?=0.91, p=0.0028）。

光聲成像與靜脈造影的互補(bǔ)性

為了評(píng)估腫瘤灌注情況，研究團(tuán)隊(duì)在PA成像的基礎(chǔ)上結(jié)合了靜脈造影。通過靜脈注射微泡造影劑，并實(shí)時(shí)跟蹤其在腫瘤內(nèi)的分布和清除情況，研究團(tuán)隊(duì)能夠同時(shí)獲取腫瘤的氧合度、灌注情況和解剖結(jié)構(gòu)信息。這種雙模態(tài)成像方法為縱向?qū)崟r(shí)監(jiān)測(cè)腫瘤血管生成和治療反應(yīng)提供了有力的工具。

胰腺皮下腫瘤異種移植物腫瘤缺氧的評(píng)價(jià)。A)缺氧s.c腫瘤的典型氧-血紅蛋白PA圖像。b模式圖像（左圖）和氧飽和度圖（氧- hemo PA成像，右圖）并排放置，顯示相同的成像窗口。熱圖表示氧飽和度水平，范圍從100%（紅色）到0%（深藍(lán)色）。低于總Hb定義閾值（最大強(qiáng)度的20%）的斑點(diǎn)為黑色（見方法）。黃線代表腫瘤區(qū)域。B)同一s.c.腫瘤的代表性缺氧染色（棕色）。黑線表示腫瘤區(qū)域。C)圖2A所示缺氧s.c腫瘤的代表性H&E染色。D)非缺氧性s.c腫瘤的典型氧血紅蛋白圖像。b模式圖像和氧飽和度圖

（氧合血紅光聲圖像放置在右側(cè)顯示相同的成像窗口）。熱圖如上所示。黃線代表腫瘤區(qū)域。E)非缺氧s.c腫瘤的代表性吡莫硝唑染色，因此缺乏棕色染色，如圖2D所示。黑線表示腫瘤區(qū)域。F)具有代表性的非缺氧性sc腫瘤的H&E染色。G)基于pa的so2測(cè)量和相應(yīng)的吡硝唑染色強(qiáng)度線性回歸分析的圖形表示。將吡莫硝唑強(qiáng)度歸一化，將數(shù)據(jù)集中的最高值調(diào)整為100，將最低強(qiáng)度設(shè)置為0。95%置信區(qū)間的置信帶如圖（虛線）所示。

結(jié)論

本研究表明，雙波長(zhǎng)PA成像技術(shù)能夠?qū)崟r(shí)、可靠地檢測(cè)小鼠腫瘤模型中的缺氧區(qū)域，并與免疫組化結(jié)果高度一致。通過結(jié)合B模式US和靜脈造影技術(shù)，該方法還能夠提供關(guān)于腫瘤灌注和解剖結(jié)構(gòu)的詳細(xì)信息。因此，雙模態(tài)PA/US成像技術(shù)在臨床前癌癥研究中具有廣泛的應(yīng)用前景，可用于實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)腫瘤生長(zhǎng)和治療反應(yīng)。

Hypoxyprobe? Omni Kit 試劑盒的作用和價(jià)值

(HP Catalog # HP3)

產(chǎn)品鏈接：

http://site.hypoxyprobe.com/knowledge-center-articles/HP3-Hypoxyprobe-Omni-Kit-Insert-2020.pdf

在本研究中，Hypoxyprobe? Omni Kit 試劑盒發(fā)揮了至關(guān)重要的作用。該試劑盒提供了一種簡(jiǎn)便、可靠的方法來可視化組織中的缺氧區(qū)域。通過結(jié)合Pimonidazole和PAb2627AP抗體進(jìn)行免疫組化染色，研究團(tuán)隊(duì)能夠準(zhǔn)確評(píng)估腫瘤的缺氧狀態(tài)。這種方法不僅適用于小鼠模型，還具有潛在的臨床應(yīng)用價(jià)值。此外，該試劑盒的易用性和高靈敏度也使得它成為研究腫瘤缺氧的理想工具之一。

討論

隨著基因工程小鼠模型的不斷發(fā)展和新興藥物靶點(diǎn)的多樣性增加，對(duì)臨床前成像和縱向監(jiān)測(cè)治療反應(yīng)的需求也日益增長(zhǎng)。PA成像技術(shù)作為一種非侵入性功能成像方法，能夠利用內(nèi)源性對(duì)比劑（如血紅蛋白）進(jìn)行成像，并與外源性對(duì)比劑相結(jié)合以拓寬其應(yīng)用范圍。本研究通過結(jié)合PA和US技術(shù)，實(shí)現(xiàn)了對(duì)腫瘤氧合度、灌注和解剖結(jié)構(gòu)的實(shí)時(shí)、多模態(tài)成像，為臨床前癌癥研究提供了一種強(qiáng)大的工具。

此外，PA成像技術(shù)還具有廣泛的臨床應(yīng)用前景。例如，在內(nèi)窺鏡超聲與PA成像的結(jié)合中，可以實(shí)現(xiàn)對(duì)消化道腫瘤的實(shí)時(shí)評(píng)估；在黑色素瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移研究中，可以利用黑色素作為內(nèi)源性對(duì)比劑進(jìn)行成像。隨著靶向外源性對(duì)比劑的不斷開發(fā)和應(yīng)用，PA成像技術(shù)將在未來發(fā)揮更加重要的作用。

展望

本研究為實(shí)時(shí)評(píng)估組織缺氧提供了一種新的方法，并展示了PA/US雙模態(tài)成像技術(shù)在臨床前癌癥研究中的應(yīng)用潛力。隨著技術(shù)的不斷發(fā)展和完善，該方法有望在未來得到更廣泛的應(yīng)用和推廣。同時(shí)，Hypoxyprobe? Omni Kit 試劑盒作為一種可靠、高效的缺氧檢測(cè)工具，也將在腫瘤缺氧研究中發(fā)揮越來越重要的作用。