從牛心肌中純化的肌鈣蛋白/原肌球蛋白復合物（TT復合物）（1）。TT復合物由五種蛋白質組成：原肌球蛋白α、原肌球蛋白β、肌鈣蛋白C、肌鈣蛋白I和肌鈣蛋白T，其化學計量比為1:1:1:1:1（見圖1）。該復合物已在F-肌動蛋白/鈣激活肌球蛋白ATP酶檢測中被確定具有生物活性（見生物活性檢測）。該復合物以白色凍干粉的形式提供。

純度：

通過掃描分光光度法測定考馬斯亮藍染色的蛋白質在4-20%梯度聚丙烯酰胺凝膠上的純度。TT復合物的純度被確定為85%（見圖2a）。使用針對每個組分的抗體來驗證每個組分的存在（見圖2b）。

圖2a：20 ?g的TT復合物蛋白在4-20% SDS-PAGE系統(tǒng)中通過電泳分離，并用考馬斯亮藍染色。箭頭1表示肌鈣蛋白T（38 kDa），箭頭2表示原肌球蛋白（α+β，32 kDa），箭頭3表示肌鈣蛋白I（24 kDa），箭頭4表示肌鈣蛋白C（18 kDa）。

圖2b：2 ?g的TT復合物蛋白在4-20% SDS-PAGE系統(tǒng)中通過電泳分離，轉印到PVDF膜上，并用特異性單克隆抗體進行探針檢測。泳道3：原肌球蛋白（α+β，32 kDa，單克隆抗體克隆：TM311），泳道4：肌鈣蛋白T（38 kDa，單克隆抗體克隆JLT-12來自Sigma）（抗體給出24 kDa信號——與肌鈣蛋白I交叉反應？），泳道5：肌鈣蛋白I（24 kDa，單克隆抗體克隆MAB1691），泳道6：肌鈣蛋白C（18 kDa，單克隆抗體克隆7B9）。

艾美捷原肌球蛋白/原肌球調(diào)節(jié)蛋白復合物,牛心臟（#CS-TT05）用途：

1測量與細絲結合時的鈣激活肌球蛋白ATP酶活性。

2識別/表征影響TT復合體調(diào)控和肌球蛋白ATP酶活性的蛋白質或小分子。

3識別/表征影響肌球蛋白/F-肌動蛋白相互作用的蛋白質或小分子。

儲存與復溶：

短暫離心以將產(chǎn)品收集到試管底部。通過加入冰凍的Milli-Q水將蛋白質復溶至3 mg/ml。蛋白質將處于以下緩沖液中：20 mM PIPES，pH 7.0，25 mM KCl，5%（w/v）蔗糖和1%（w/v）葡聚糖。為了保持蛋白質的高生物活性，建議將蛋白質溶液分裝成“實驗用量”，在液氮中快速冷凍并儲存于-70°C。如果儲存于-70°C，蛋白質可穩(wěn)定保存6個月。蛋白質不應暴露于反復的凍融循環(huán)中。凍干的蛋白質在4°C干燥（<10%濕度）條件下可穩(wěn)定保存1年。

生物活性檢測：

TT復合物的生物活性可以通過其調(diào)節(jié)F-肌動蛋白激活肌球蛋白ATP酶的能力來確定。檢測方法是首先使肌動蛋白聚合形成F-肌動蛋白，然后將TT復合物與肌動蛋白絲以化學計量比混合。這會形成類似于肌肉纖維細絲的包被絲。這些絲在100,000×g下離心，沉淀物在反應緩沖液中重新懸浮，從而純化鈣敏感復合物。肌球蛋白以亞化學計量比加入，并用ATP和鈣啟動反應。嚴格的質量控制確保在沒有鈣的情況下，TT復合物完全抑制肌球蛋白ATP酶。加入10 ?M鈣后，肌球蛋白ATP酶將被恢復。鈣與肌鈣蛋白C結合，使其從F-肌動蛋白上解離，從而允許肌球蛋白結合。

試劑

1. 心臟TT復合物（1×1 mg，貨號TT05）

2. 心臟肌球蛋白S1（0.25 mg），貨號MYS03

3. 心臟肌動蛋白（1 mg，貨號AD99-A）

4. ATP酶生化試劑盒（貨號BK051）

5. 50 mM Tris-HCl，pH 7.5中的100 mM ATP（100 ?l）

6. 水中的1 M二硫蘇糖醇（100 ?l）

7. PM12反應緩沖液（12 mM Pipes-KOH，pH 7.0，2 mM MgCl?）

8. 500 mM EGTA-Na，pH 8.0

設備：

1. 能夠在360 nm（±5 nm帶寬）處測量吸光度的分光光度計。推薦使用Spectra-Max M2（Molecular Devices），基于濾光片的機器不適合。

2. 半面積96孔微量滴定板（Corning貨號3696或3697）

3. 多通道移液器

方法：

以下為主要步驟：

步驟1：準備所需的試劑和化合物。（30分鐘）

步驟2：制備F-肌動蛋白聚合物儲備液。（1小時）

步驟3：制備細絲儲備液。（1.5小時）

步驟4：準備馬達混合物和酶標儀。（15分鐘）

步驟5：將馬達混合物加入孔中并啟動反應/酶標儀。（10分鐘）

F-肌動蛋白聚合物儲備液：

1. 用2.5 ml緩沖液將AD99復溶至0.4 mg/ml（測量蛋白濃度以獲得更好的可重復性），緩沖液成分：5 mM Pipes-KOH，pH 7.0，500 ?M ATP，500 ?M DTT。

2. 在室溫下放置10分鐘以溶解肌動蛋白。

3. 然后加入2.0 mM MgCl?和2.0 mM EGTA，在室溫下孵育20分鐘以聚合。（室溫下保質期1小時）

原肌球蛋白/原肌球調(diào)節(jié)蛋白復合物,牛心臟文獻參考：

1. J.M Murray. 1982. Hybridization and reconstitution of the thin filament. Methods in Enzymology, 85, p.15-17.

2. M.J. Holroyde et al. 1980. The calcium and magnesium binding sites on cardiac troponin their role in the regulation of myofibrillar adenosine triphosphatase.