適當(dāng)使用各種糖苷酶可以確定唾液酸化（僅使用神經(jīng)氨酸酶）以及N-連接糖鏈（僅使用PNGase F）和O-連接糖鏈（使用神經(jīng)氨酸酶、β-半乳糖苷酶、O-糖苷酶和β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶）的特定存在。另外，QA-Bio在DeGlycoMx試劑盒（KE-DGMX）中提供了一種20微升瓶中預(yù)混合的酶溶液。

艾美捷QA-Bio-酶促碳水化合物釋放試劑盒包含以下每種酶20微升：

PNGase F（腦膜敗血黃桿菌）

O-糖苷酶（肺炎鏈球菌）

神經(jīng)氨酸酶（尿素桿菌）

β-半乳糖苷酶（肺炎鏈球菌）

β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶（肺炎鏈球菌）

其他提供的試劑：

反應(yīng)緩沖液

變性溶液

Triton X

牛血清白蛋白（對(duì)照）

QA-Bio-酶促碳水化合物釋放試劑盒特異性：

酶促CarboRelease試劑盒將去除糖蛋白上的糖基，從糖蛋白中移除所有N-連接的寡糖和許多O-連接的寡糖。使用酶PNGase F去除N-連接（天冬酰胺連接的）。此外，所有絲氨酸或蘇氨酸連接的（O-連接）Gal-(b1-3)-GalNAc-(a1)和所有唾液酸替代的Gal-(b1-3)-GalNAc-(a1)將使用神經(jīng)氨酸酶和O-糖苷酶的組合去除。添加β-半乳糖苷酶和葡糖胺苷酶將有助于較大O-連接結(jié)構(gòu)的去糖基化。

QA-Bio-酶促碳水化合物釋放試劑盒容量：

協(xié)議中推薦的酶量足以在給定時(shí)間內(nèi)去除大約100微克的平均糖蛋白的糖基。PNGase F裂解通常是限速反應(yīng)，因?yàn)榧词故窃谔堑鞍鬃冃院螅恍┛臻g位阻的N-連接殘基的去除也很慢。由于所有酶在反應(yīng)條件下幾天內(nèi)都保持活性，如果延長(zhǎng)孵化時(shí)間，可以去除更多的糖蛋白。相反，如果正在裂解的糖蛋白量遠(yuǎn)少于100微克，則無(wú)需使用推薦的酶量。這些酶可以稀釋到1X反應(yīng)緩沖液7中。它們?cè)?°C稀釋狀態(tài)下保持穩(wěn)定。

牛血清白蛋白對(duì)照蛋白：

牛血清白蛋白含有唾液酸化的N-和O-連接的寡糖13。

注意：市售的Fetuin制劑含有將最終降解蛋白質(zhì)的蛋白酶。Fetuin對(duì)照已經(jīng)經(jīng)過(guò)90°C加熱10分鐘以滅活蛋白酶。Fetuin溶液可以?xún)?chǔ)存在4°C。

變性協(xié)議：

在Eppendorf管中，將100微克或更少的糖蛋白溶解在30微升去離子水中。

添加10微升5X反應(yīng)緩沖液7和2.5微升變性溶液。輕輕混合。

在100°C下加熱5分鐘。 注意：一些蛋白質(zhì)可能在與SDS加熱時(shí)沉淀。在這種情況下，省略熱處理，添加酶后將孵化時(shí)間延長(zhǎng)至24小時(shí)。

冷卻至室溫。添加2.5微升Triton X-100溶液。輕輕混合。 注意：未添加Triton X-100可能導(dǎo)致一些酶活性降低。

添加每種酶1微升。

在37°C下孵化3小時(shí)。

按選擇的方法進(jìn)行分析。

或者，可以單獨(dú)或順序添加酶，以確定糖蛋白上存在的糖鏈類(lèi)型。

非變性協(xié)議：

在Eppendorf管中，將100微克或更少的糖蛋白溶解在35微升去離子水中。

添加10微升5X反應(yīng)緩沖液7。

添加每種酶1微升。

在37°C下孵化24小時(shí)。

應(yīng)使用變性協(xié)議進(jìn)行去糖基化，以提供完全去糖基化蛋白的凝膠標(biāo)準(zhǔn)。然后，可以將原生蛋白的位置與此標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行比較，以判斷去糖基化的程度。

艾美捷科技是QA-Bio的中國(guó)代理商，為科研工作者提供優(yōu)質(zhì)的產(chǎn)品與服務(wù)。