CRISPR/Cas是機體長期進化形成的RNA指導的降解入侵病毒或噬菌體DNA的適應性免疫系統(tǒng)。根據(jù)Cas基因核心元件序列的不同，CRISPR/Cas免疫系統(tǒng)被分為3種類型：I型、Ⅱ型和Ⅲ型。I型和Ⅲ型CRISPR/Cas免疫系統(tǒng)需要多個Cas蛋白形成復合體切割DNA雙鏈，而Ⅱ型CRISPR/Cas免疫系統(tǒng)只需要一個Cas9蛋白來切割DNA雙鏈，目前Ⅱ型系統(tǒng)是被改造的最為成功的人工核酸酶。

Ⅱ型CRISPR/Cas免疫系統(tǒng)以Cas9蛋白和向導RNA為核心，其中Cas9蛋白是一種DNA內切酶，當短鏈外源DNA整合在CRISPR基因組中，轉錄加工成CRISPR RNA（CrRNA），這些CrRNA參與反式調控激活CrRNA（tracrRNAs），指導Cas9蛋白特異性位點剪切DNA。然而，最近有研究發(fā)現(xiàn)，這兩種RNA可以被“改裝”成一個向導RNA（single-guide RNA，SgRNA）,可引導Cas9蛋白正確識別并切割特定序列，為CRISPR-Cas9基因編輯技術廣泛應用奠定基礎。因此，Cas9 蛋白作為一種基因組編輯工具在 DNA 中引起定點雙鏈斷裂，受到了全世界的關注。

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Cas9蛋白ELSIA定量檢測試劑盒實驗結果：

圖1. Cas9標準曲線

圖2. 在轉染的293細胞中檢測Cas9。用Cas9哺乳動物表達載體瞬時轉染細胞。48h后，細胞在RIPA緩沖液中裂解，測定Cas9蛋白濃度。用Cas9 ELISA試劑盒分別檢測無細胞裂解液樣本 (Neg)、存在50ng/mL Cas9蛋白(Pos)樣本、轉染對照(mock轉染)蛋白裂解液以及Cas9轉染的裂解液。

圖3. 純化的重組Cas9蛋白：泳道1：SeeBlue Plus2 MW標準品；泳道2：重組的Cas9。純化的重組Cas9蛋白用作免疫原以產(chǎn)生ELISA抗體。

重組的Cas9蛋白的序列（下劃線部分是Cas9蛋白全長）：

MGSSHHHHHHSSGLVPRGSHMASMTGGQQMGRGSEFELRRQACGRMDKKYSIGLDIGTNSVGWAVITD EYKVPSKKFKVLGNTDRHSIKKNLIGALLFDSGETAEATRLKRTARRRYTRRKNRICYLQEIFSNEMA KVDDSFFHRLEESFLVEEDKKHERHPIFGNIVDEVAYHEKYPTIYHLRKKLVDSTDKADLRLIYLALA HMIKFRGHFLIEGDLNPDNSDVDKLFIQLVQTYNQLFEENPINASGVDAKAILSARLSKSRRLENLIA QLPGEKKNGLFGNLIALSLGLTPNFKSNFDLAEDAKLQLSKDTYDDDLDNLLAQIGDQYADLFLAAKN LSDAILLSDILRVNTEITKAPLSASMIKRYDEHHQDLTLLKALVRQQLPEKYKEIFFDQSKNGYAGYI DGGASQEEFYKFIKPILEKMDGTEELLVKLNREDLLRKQRTFDNGSIPHQIHLGELHAILRRQEDFYP FLKDNREKIEKILTFRIPYYVGPLARGNSRFAWMTRKSEETITPWNFEEVVDKGASAQSFIERMTNFD KNLPNEKVLPKHSLLYEYFTVYNELTKVKYVTEGMRKPAFLSGEQKKAIVDLLFKTNRKVTVKQLKED YFKKIECFDSVEISGVEDRFNASLGTYHDLLKIIKDKDFLDNEENEDILEDIVLTLTLFEDREMIEER LKTYAHLFDDKVMKQLKRRRYTGWGRLSRKLINGIRDKQSGKTILDFLKSDGFANRNFMQLIHDDSLT FKEDIQKAQVSGQGDSLHEHIANLAGSPAIKKGILQTVKVVDELVKVMGRHKPENIVIEMARENQTTQ KGQKNSRERMKRIEEGIKELGSQILKEHPVENTQLQNEKLYLYYLQNGRDMYVDQELDINRLSDYDVD HIVPQSFLKDDSIDNKVLTRSDKNRGKSDNVPSEEVVKKMKNYWRQLLNAKLITQRKFDNLTKAERGG LSELDKAGFIKRQLVETRQITKHVAQILDSRMNTKYDENDKLIREVKVITLKSKLVSDFRKDFQFYKV REINNYHHAHDAYLNAVVGTALIKKYPKLESEFVYGDYKVYDVRKMIAKSEQEIGKATAKYFFYSNIM NFFKTEITLANGEIRKRPLIETNGETGEIVWDKGRDFATVRKVLSMPQVNIVKKTEVQTGGFSKESIL PKRNSDKLIARKKDWDPKKYGGFDSPTVAYSVLVVAKVEKGKSKKLKSVKELLGITIMERSSFEKNPI DFLEAKGYKEVKKDLIIKLPKYSLFELENGRKRMLASAGELQKGNELALPSKYVNFLYLASHYEKLKG SPEDNEQKQLFVEQHKHYLDEIIEQISEFSKRVILADANLDKVLSAYNKHRDKPIREQAENIIHLFTL TNLGAPAAFKYFDTTIDRKRYTSTKEVLDATLIHQSITGLYETRIDLSQLGGDGGSGPPKKKRKVYPYDVPDYAC

最新引用文獻：

1、Van Cleemput, J. et al. (2021). CRISPR/Cas9-Constructed Pseudorabies Virus Mutants Reveal the Importance of UL13 in Alphaherpesvirus Escape from Genome Silencing. J Virol. 95(6):e02286-20. doi: 10.1128/JVI.02286-20.

2、Lee, M.H. et al. (2021).  Cellular reprogramming with multigene activation by the delivery of CRISPR/dCas9 ribonucleoproteins via magnetic peptide-imprinted chitosan nanoparticles. Mater Today Bio. 9:100091. doi: 10.1016/j.mtbio.2020.100091.

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