PCR，即聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR），是一種用于放大擴(kuò)增特定的DNA片段的分子生物學(xué)技術(shù)。今天匯總PCR的知識(shí)點(diǎn)，例如終點(diǎn)PCR、定量PCR、反轉(zhuǎn)錄PCR等相關(guān)知識(shí)做基本介紹。

一、RNA定量

如何精準(zhǔn)地檢測(cè)到病毒（定性）？如何有效判定出樣本中的病毒含量（定量）？借助分子生物學(xué)技術(shù)可以精準(zhǔn)檢測(cè)病原體，其中的一步法RT-qPCR技術(shù)可被廣泛用于RNA病毒類型判定、病毒亞型判定、病毒定量及病毒突變體等方面。

一步法RT-qPCR(One-Step reverse transcription-quantitative PCR)用于以RNA為起始模板的定性和定量分析，將RNA逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA的過程與靶標(biāo)基因的PCR擴(kuò)增于一管內(nèi)依次進(jìn)行，利用熒光來監(jiān)控PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的變化，進(jìn)而判斷RNA初始量的技術(shù)即為一步法RT-qPCR技術(shù)。

RT-qPCR根據(jù)化學(xué)發(fā)光原理可以分為兩大類：

一類為染料類，包括SYBR@Green I，通過熒光染料來指示產(chǎn)物的增加；

一類為探針類，包括TaqMan@探針，利用與靶序列特異雜交的探針來指示擴(kuò)增產(chǎn)物的增加。

二、miRNA的定量方法

常用的對(duì)miRNA的定量方法主要有兩種，分別為莖環(huán)引物法、加尾法。提供基于加尾法的All-in-One miRNA qRT-PCR 系列試劑盒和驗(yàn)證引物，用于miRNA表達(dá)量的高效檢測(cè)。

三、高GC含量PCR

在DNA（A、T、C、G）4種堿基中，鳥嘌呤（G）和胞嘧啶（C）所占的比率稱為GC含量。因?yàn)镚、C之間形成三對(duì)氫鍵，解鏈所需能量較高，所以模板很難打開，高GC含量（G+C≥60%）模板擴(kuò)增中所面臨的主要困難是模板中容易形成穩(wěn)定的二級(jí)結(jié)構(gòu)妨礙DNA聚合酶在模板上的推進(jìn)，而且模板上可能存在多個(gè)非特異性的引物復(fù)性位點(diǎn)，導(dǎo)致非特異性擴(kuò)增，甚至很多時(shí)候擴(kuò)增不出靶基因。

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四、PCR疑難問題

1、終點(diǎn)PCR

終點(diǎn)PCR，顧名思義既是對(duì)PCR擴(kuò)增反應(yīng)的終產(chǎn)物進(jìn)行定性及定量分析，在反應(yīng)過程中無法監(jiān)測(cè)反應(yīng)進(jìn)行情況，只有反應(yīng)完成后通過跑膠得到結(jié)果。

2、熒光定量PCR

實(shí)時(shí)熒光定量PCR（quantitative PCR, qPCR）通過對(duì)PCR擴(kuò)增反應(yīng)中的每一個(gè)循環(huán)產(chǎn)物熒光信號(hào)的實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)從而實(shí)現(xiàn)對(duì)起始模板的定性及定量分析。目前它主要通過兩種方式——熒光染料或者熒光標(biāo)記的探針對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行標(biāo)記跟蹤，實(shí)時(shí)在線監(jiān)控反應(yīng)過程，并結(jié)合相應(yīng)的軟件對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行分析，計(jì)算待測(cè)樣品模板的初始濃度。

3、逆轉(zhuǎn)錄PCR

逆轉(zhuǎn)錄 PCR（Reverse TranscriptionPCR, RT-PCR）是一種以 RNA 為樣本，RNA鏈被逆轉(zhuǎn)錄成為互補(bǔ) DNA（cDNA），再以此為模板通過 PCR 進(jìn)行 DNA 擴(kuò)增。在實(shí)際應(yīng)用中，RT-PCR 分為一步法 RT-PCR 和兩步法 RT-PCR。整個(gè)反轉(zhuǎn)錄實(shí)驗(yàn)過程有三個(gè)重要的因素，分別是RNA模板、反轉(zhuǎn)錄時(shí)所使用的引物類型、反轉(zhuǎn)錄酶 。

五、轉(zhuǎn)長(zhǎng)片段PCR

傳統(tǒng)的PCR通常只能擴(kuò)增3kb以內(nèi)的短片段，對(duì)于3kb以上的長(zhǎng)片段很難進(jìn)行有效擴(kuò)增。

艾美捷提供相對(duì)長(zhǎng)片段PCR的兩種DNA聚合酶（FIREPol? Blend Master Mix）進(jìn)行反應(yīng)：一種是常規(guī)PCR反應(yīng)中應(yīng)用的耐熱FIREPol? DNA聚合酶，它具有很強(qiáng)的延伸能力，依賴此酶進(jìn)行鏈的延伸；另一種是具有3’→5’核酸外切酶活性的DNA聚合酶，它具有較好的校讀功能，可以將錯(cuò)配的堿基切割下來重新利用第一種酶進(jìn)行鏈的延伸。兩種酶各有優(yōu)缺點(diǎn)，充分利用第一種酶的延伸能力和第二種酶的校讀功能，使兩種酶在反應(yīng)中相輔相成，完成長(zhǎng)片段DNA的擴(kuò)增。