m6A修飾是mRNA上豐度最高的內(nèi)部修飾，RNA修飾的通過(guò)特定的識(shí)別蛋白：YTHDF蛋白家族、YTHDC蛋白家族、IGF2BP蛋白家族等均可特異性識(shí)別mRNA上的m6A位點(diǎn)，從而調(diào)控mRNA代謝。mRNA上存在很多不同種類的化學(xué)修飾、比如m1G、m5G、m7G等。2019年，證實(shí)了m7G修飾存在于哺乳動(dòng)物mRNA和miRNA的內(nèi)部，并報(bào)道了METTL1-WDR4復(fù)合體作為相應(yīng)的甲基化轉(zhuǎn)移酶。同時(shí)，中國(guó)科學(xué)院北京基因組研究所楊運(yùn)桂教授開(kāi)發(fā)了新的檢測(cè)技術(shù)，獲得了mRNA內(nèi)部m7G修飾 的高分辨率圖譜。然而迄今為止，mRNA內(nèi)部m7G修飾的特異性識(shí)別蛋白尚不清楚，這極大地阻礙了對(duì)mRNA內(nèi)部m⁷G修飾功能的研究。因此，鑒定mRNA內(nèi)部m7G修飾的特異性識(shí)別蛋白具有十分重要的意義。

2023.6.27，來(lái)自美國(guó)希望之城國(guó)家醫(yī)療中心陳建軍教授、蘇瑞助理教授及上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟(jì)醫(yī)院的夏強(qiáng)教授合作，在Cell上發(fā)表標(biāo)題題為 QKI shuttles internal m7G-modified transcripts into stress granules and modulates mRNA metabolism 的研究文章，篩選并鑒定出mRNA內(nèi)部m7G修飾的首個(gè)識(shí)別蛋白QKI (Quaking)，而且報(bào)道了在應(yīng)激狀態(tài)下QKI對(duì)細(xì)胞應(yīng)激顆粒內(nèi)具有m7G修飾mRNA的動(dòng)態(tài)調(diào)控作用。

研究者首先驗(yàn)證了METTL1-WDR4甲基轉(zhuǎn)移酶復(fù)合體對(duì)mRNA內(nèi)部m7G的修飾作用。敲除METTL1/WDR4顯著降低small RNA和mRNA內(nèi)部m7G的豐度；過(guò)表達(dá)野生型METTL1可增加small RNA和mRNA內(nèi)部m7G的水平。除此之外，研究者還發(fā)現(xiàn)細(xì)胞質(zhì)mRNA上的m7G總體豐度大于細(xì)胞核mRNA。為了篩選mRNA內(nèi)部m7G修飾的特異性識(shí)別蛋白，研究者利用體外轉(zhuǎn)錄技術(shù)（in vitro transcription）合成了兩條僅含有G或m7G的單鏈寡核苷酸 (ssRNA) ，并將其與HepG2全細(xì)胞裂解液進(jìn)行孵育，利用RNA pull down和質(zhì)譜技術(shù)聯(lián)合分析，鑒定出能特異性識(shí)別m7G-ssRNA的RNA結(jié)合蛋白。eCLIP-seq數(shù)據(jù)庫(kù)分析結(jié)果表明，在QKI、IGF2BP2和LRPPRC這三個(gè)候選蛋白中，只有QKI含有與METTL1類似的GA-GA-基序（motif），正好是先前報(bào)道的mRNA內(nèi)部m7G修飾基序。QKI是STAR蛋白家族的一員，主要包含QKI5、QKI6和QKI7三個(gè)亞型。細(xì)胞內(nèi)（in cellulo）和細(xì)胞外（cell-free）RNA pull-down實(shí)驗(yàn)表明QKI5、QKI6與QKI7均傾向與含有內(nèi)部m⁷G修飾的ssRNA結(jié)合。接著研究者綜合分析了m7G甲基化RNA測(cè)序（MeRIP-seq）以及QKI5/QKI6/QKI7 RNA免疫共沉淀測(cè)序（RIP-seq）的數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)兩者都具有類似的GANGAN（N=A/C/U/G）基序。此外，METTL1敲除可以顯著抑制QKI與靶mRNA的結(jié)合，提示QKI與靶mRNA的結(jié)合至少部分依賴于METTL1所介導(dǎo)的內(nèi)部m⁷G修飾。

此前的研究發(fā)現(xiàn)，活性氧和熱應(yīng)激刺激可動(dòng)態(tài)調(diào)控mRNA內(nèi)部m7G修飾的水平，但其背后的機(jī)制并不明確。在各種應(yīng)激源的刺激下，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)RNA、蛋白翻譯復(fù)合物和RNA結(jié)合蛋白通過(guò)液-液相分離組裝成無(wú)膜細(xì)胞器結(jié)構(gòu)，稱為應(yīng)激顆粒（stress granule）。應(yīng)激顆粒將特定的蛋白質(zhì)和mRNA分子與細(xì)胞質(zhì)分隔開(kāi)來(lái)，對(duì)應(yīng)激狀態(tài)下mRNA的代謝起到了關(guān)鍵的調(diào)節(jié)作用。G3BP1是上述應(yīng)激顆粒中RNA-蛋白互作網(wǎng)絡(luò)中的核心調(diào)控分子。研究者通過(guò)免疫共沉淀（Co-IP）、免疫熒光和鄰位連接技術(shù)（PLA）等檢測(cè)方法發(fā)現(xiàn)QKI6和QKI7可以與G3BP1發(fā)生相互作用。在正常情況下，具有m7G修飾的mRNA分布于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)；而在應(yīng)激狀態(tài)下，具有m7G修飾的mRNA會(huì)向應(yīng)激顆粒內(nèi)聚集。QKI 敲低顯著降低應(yīng)激顆粒內(nèi)具有m7G修飾mRNA比例，野生型QKI7過(guò)表達(dá)可以大體上恢復(fù)這一表型。

上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，應(yīng)激狀態(tài)下QKI可以識(shí)別并結(jié)合具有內(nèi)部m7G修飾的mRNA，通過(guò)與G3BP1發(fā)生相互作用從而將靶mRNA限制在應(yīng)激顆粒內(nèi)。那么，QKI將靶mRNA攜帶至應(yīng)激顆粒之后，對(duì)其代謝有何影響呢？

為了回答這一問(wèn)題，研究者綜合分析了應(yīng)激狀態(tài)下m7G MeRIP-seq、QKI7 RIP-seq以及SG RNA-seq的數(shù)據(jù)。測(cè)序結(jié)果同樣提示，具有m7G修飾并能與QKI7結(jié)合的mRNA更傾向在應(yīng)激顆粒中聚集。KEGG通路分析表明這些基因多富集在“Hippo signaling pathway”和“pathway in cancer”兩個(gè)通路。接下來(lái)研究者開(kāi)展了mRNA穩(wěn)定性測(cè)序（mRNA stability profiling）和多聚核糖體分析（Polysome profiling），實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在應(yīng)激狀態(tài)下QKI可以調(diào)控Hippo 信號(hào)通路關(guān)鍵基因等靶基因的穩(wěn)定性和翻譯效率。

應(yīng)激顆粒對(duì)腫瘤細(xì)胞在極端環(huán)境下的生存至關(guān)重要。長(zhǎng)春新堿、紫杉醇、索拉菲尼等常用化療藥物均可誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞形成應(yīng)激顆粒。TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)分析表明，QKI與各種應(yīng)激顆粒關(guān)鍵基因的表達(dá)均存在顯著的正相關(guān)性。研究者進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)阿霉素（doxorubicin）也可誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞形成應(yīng)激顆粒，且QKI7與G3BP1共同定位于阿霉素誘導(dǎo)形成的應(yīng)激顆粒中。體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)表明，QKI7過(guò)表達(dá)可顯著增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞對(duì)阿霉素的敏感性，提示應(yīng)激顆粒對(duì)腫瘤化療耐藥的作用可能與mRNA內(nèi)部m⁷G修飾有關(guān)。

綜上，該研究揭示了QKI作為mRNA內(nèi)部m7G修飾識(shí)別蛋白的新功能，對(duì)應(yīng)激顆粒內(nèi)部mRNA的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)提出了新的機(jī)制，并為靶向QKI/G3BP1從而優(yōu)化腫瘤治療這一新策略提供了理論依據(jù)。