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懷疑是樣品問(wèn)題，可能是： 

1，樣品不能反復(fù)凍融； 

2，樣品未加蛋白酶抑制劑。同時(shí)，建議檢查WesternBlot 過(guò)程， 提高一抗?jié)舛取?duì)于加蛋白酶抑制 劑來(lái)說(shuō)，一般加PMSF 就可以了，最好能多加幾中種蛋白酶抑制劑。

①免疫組化可以用來(lái)進(jìn)行定位，但是不能精確定量，而且有時(shí)會(huì)有假陽(yáng)性，不易與背景區(qū)分；Westernblot 可以特異性檢測(cè)某個(gè)蛋白質(zhì)分子，進(jìn)行定量，但是不能定位。 

②兩種實(shí)驗(yàn)的一抗有時(shí)候不能通用，公司的產(chǎn)品說(shuō)明一般都會(huì)說(shuō)明可以進(jìn)行什么實(shí)驗(yàn)，在免疫 組化時(shí)，是否適合石蠟切片或者冰凍切片。

NaF 是一種廣譜磷酸化酶的抑制劑，一般最好加。但是不加也可以，大部分時(shí)候是不用加的。

可能是：

a)樣品濃度過(guò)低；

b)轉(zhuǎn)移時(shí)間不夠。

a)抗原形成了二聚體。增多巰基乙醇量，煮沸變性時(shí)間延長(zhǎng)，可以打開(kāi)二聚體。

b)蛋白本身的修飾 如：糖基化，磷酸化等。

DAB 有毒，但是比較靈敏，是 HRP 最敏感的底物；ECM 結(jié)果容易控制，但被催化時(shí)靈敏度差一 點(diǎn)，但如果達(dá)到閥值，就特別靈敏，可以檢測(cè)pg 級(jí)抗原。要看你實(shí)驗(yàn)的情況。

a)可能是紅燈造成的,膠片本來(lái)就被曝光了，可以在完全黑暗的情況下操作.看是否有改善.；

b)顯影 時(shí)間過(guò)長(zhǎng)。

如果能夠排除下面的幾個(gè)問(wèn)題那么問(wèn)題多半出現(xiàn)在一抗和抗原制備上。

a)二抗的HRP 活性太強(qiáng)，將底物消耗光； 

b)ECM 底物中H2O2，不穩(wěn)定，失活； 

c)ECL 底物沒(méi)覆蓋到相應(yīng)位置； 

d)二抗失活。

你的一抗?jié)舛容^高，二抗上 HRP 催化活力太強(qiáng)，同時(shí)你的顯色底物處于一個(gè)臨界點(diǎn)，反應(yīng)時(shí)間不長(zhǎng)，將周?chē)孜锎呋辏纬闪丝瞻准础胺戳连F(xiàn)象”。將一抗和二抗?jié)舛冉档停蚋鼡Q新底物。

減少抗原上樣量，降低一抗?jié)舛龋淖円豢狗跤龝r(shí)間，提高牛奶濃度。

可以加大抗原上樣量，這是最主要的。同時(shí)也可以將一抗稀釋比例降低。

可以選擇 0.2μml 的膜，同時(shí)縮短轉(zhuǎn)移時(shí)間。也可以將兩張膜疊在一起，再轉(zhuǎn)移。其他按步驟即 可。