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TECHNICAL COLUMN

常見問題

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問

做 WesternBlot 時(shí)，同樣的抗體免疫組化能做出，而WesternBlot 卻不能？

答

這多半是抗體的問題，要看抗體的說明，是否能做 WesternBlot 和免疫組化。
問

如果是 6×8 轉(zhuǎn)印膜，要加多少一抗？

答

一抗的稀釋度是有說明的，根據(jù)你的一抗看看就知道了，但是那么大的膜孵育體積一般最少為3－ 5ml
問

轉(zhuǎn)膜后經(jīng)麗春紅染色的條帶，為什么大蛋白分子的一端的轉(zhuǎn)膜好象不是很好，為什么？

答

這是正常的，大分子的蛋白轉(zhuǎn)移的慢，你延長轉(zhuǎn)移時(shí)間和電流，大分子一端就會(huì)好的多，但是小分子的就有可能會(huì)變淡。
問

檢測(cè)同一抗體的磷酸化和非磷酸化的抗原可以在同一張膜上嗎？

答

可以。
問

在做 WesternBlot 時(shí)，PVDF 膜用甲醇浸泡的目的？

答

PVDF 膜用甲醇泡的目的是為了活化 PVDF 膜上面的正電基團(tuán)，使它更容易跟帶負(fù)電的蛋白質(zhì)結(jié) 合，做小分子的蛋白轉(zhuǎn)移時(shí)多加甲醇也是這個(gè)目的。
問

免疫組化和WesternBlot 可以用同一種抗體嗎？

答

免疫組化時(shí)抗體識(shí)別的是未經(jīng)變性處理的抗原決定簇（又稱表位），有些表位是線性的，而有的屬于構(gòu)象型；線性表位不受蛋白變性的影響，天然蛋白和煮后的蛋白都含有；構(gòu)象型表位由于受蛋白空間結(jié)構(gòu)限制，煮后變性會(huì)消失。如果你所用的抗體識(shí)別的是蛋白上連續(xù)的幾個(gè)氨基酸，也就是線性表位，那么這種抗體可同時(shí)用于免疫組化和Western，而如果抗體識(shí)別構(gòu)象形表位，則只能用于免疫組化。
問

要做磷酸化某因子 WesternBlot，其二抗有何要求？

答

對(duì)二抗無要求，要看你實(shí)驗(yàn)條件來選擇，一般推薦用HRP 標(biāo)記的二抗。
問

WesternBlot 中抗體的可以重復(fù)應(yīng)用嗎？

答

抗體工作溶液一般不主張儲(chǔ)存反復(fù)使用，但是如抗體比較珍貴，可反復(fù)使用2－3 次。稀釋后應(yīng)在 2－3 天內(nèi)使用，4 度保存，避免反復(fù)凍融。
問

一抗，二抗的比例是否重要？

答

比較重要，調(diào)整好一抗，二抗的比例，可以去掉部分非特異的本底。
問

蛋白的上樣量有沒有什么具體的要求？

答

上樣量要根據(jù)實(shí)驗(yàn)的要求來定，如果要求是定量和半定量的WesternBlot 則上樣量要均等，如果只是要定性，則沒有太大的關(guān)系，盡量多上就行了，但是不要超載。
問

有什么方法可以提高上樣量？

答

a)可以濃縮樣品；增大上樣體積來增大上樣量；
b)用5 倍的上樣緩沖液來稀釋變性
問

問大分子量蛋白200KD，在做 western 要注意什么呢？

答

做 200kd 蛋白的WesternBlot 時(shí)要注意，分離膠最好選擇>7%的；剝膠時(shí)要小心；轉(zhuǎn)移時(shí)間需要相應(yīng)延長；要做分子量參照（否則出現(xiàn)雜帶不知道如何分析）。