半胱天冬酶（Caspases）是天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶家族的成員，在細(xì)胞凋亡中發(fā)揮核心作用。凋亡參與多種生理和病理事件，從正常的胎兒發(fā)育到癌癥、器官衰竭和神經(jīng)退行性疾病等疾病。半胱天冬酶-3（Caspase-3）是評(píng)估凋亡和理解凋亡誘導(dǎo)機(jī)制的關(guān)鍵生物標(biāo)志物。

BioAssay Systems的Caspase-3檢測(cè)試劑盒為測(cè)定生物樣本中的Caspase-3活性提供了一種便捷的方法。在檢測(cè)中，特異性底物（N-Ac-DEVD-AFC）被活化的Caspase-3切割，形成一種高熒光產(chǎn)物。熒光強(qiáng)度（激發(fā)/發(fā)射波長(zhǎng)=400/490 nm）與Caspase-3活性成正比。

作為BioAssay Systems在中國(guó)的區(qū)域總代理，艾美捷科技強(qiáng)烈推薦BioAssay Systems熱銷(xiāo)產(chǎn)品半胱天冬酶-3檢測(cè)試劑盒。產(chǎn)品僅用于科研，不可用于臨床診斷。

主要特點(diǎn)  

- 安全。非放射性檢測(cè)。  

- 便捷且高通量。均相“混合-孵育-測(cè)量”型檢測(cè)法。可在高通量篩選液體處理系統(tǒng)上輕松自動(dòng)化，每天可處理數(shù)千個(gè)樣本。

應(yīng)用  

- 測(cè)定細(xì)胞和組織裂解液中的Caspase-3活性。  

- 高通量篩選凋亡誘導(dǎo)劑和抑制劑。

試劑盒內(nèi)容  

- 檢測(cè)緩沖液：12 mL  

- 底物：240 ?L  

- DTT溶液：240 ?L  

儲(chǔ)存條件  

本產(chǎn)品在室溫下運(yùn)輸。收到后，將所有試劑儲(chǔ)存于-20°C。保質(zhì)期：收貨后12個(gè)月。

注意事項(xiàng)  

試劑僅供研究使用。使用試劑時(shí)應(yīng)遵循實(shí)驗(yàn)室試劑的常規(guī)安全措施。請(qǐng)參考材料安全數(shù)據(jù)表以獲取詳細(xì)信息。

96孔板檢測(cè)步驟  

注意：以下步驟適用于96孔板的標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)。如果細(xì)胞不是在96孔板中培養(yǎng)的，需要單獨(dú)制備細(xì)胞裂解液（參見(jiàn)“一般注意事項(xiàng)”）。建議對(duì)照組和樣本組均進(jìn)行重復(fù)檢測(cè)。

1. 細(xì)胞培養(yǎng)：將100 ?L濃度為1,000 - 100,000個(gè)細(xì)胞的細(xì)胞懸液接種到無(wú)菌黑色透明底96孔板的孔中（注意：使用的細(xì)胞數(shù)量取決于細(xì)胞系）。在細(xì)胞培養(yǎng)箱中于37°C孵育過(guò)夜。

2. 細(xì)胞處理：加入10 ?L測(cè)試化合物（例如凋亡誘導(dǎo)劑或抑制劑），使其達(dá)到所需濃度，并加入10 ?L溶劑（溶解測(cè)試化合物的培養(yǎng)基）作為對(duì)照。  孵育細(xì)胞一段時(shí)間。

3. Caspase-3檢測(cè)：檢測(cè)前，將所有試劑平衡至室溫。短時(shí)間離心試劑管。為所有檢測(cè)孔準(zhǔn)備足夠量的工作試劑。對(duì)于每個(gè)孔，將100 ?L檢測(cè)緩沖液、2 ?L底物和2 ?L DTT混合。  

- 去除檢測(cè)孔中的培養(yǎng)基。對(duì)于貼壁細(xì)胞，直接從孔中吸出培養(yǎng)基；對(duì)于懸浮細(xì)胞，以500 x g離心5分鐘，小心吸出培養(yǎng)基。  

- 立即向每個(gè)檢測(cè)孔中加入100 ?L工作試劑。通過(guò)在微孔板振蕩器上以100 - 200 rpm的轉(zhuǎn)速振蕩60秒，使試劑完全混合。工作試劑可裂解細(xì)胞并支持最佳的Caspase-3活性。  

- 在37°C下避光孵育微孔板60分鐘。

4. 讀取熒光強(qiáng)度：在激發(fā)/發(fā)射波長(zhǎng)=400/490 nm處讀取熒光強(qiáng)度。  

注意：如果Caspase-3活性較低，可以增加孵育時(shí)間，或使用更多細(xì)胞。

計(jì)算  

從對(duì)照孔的熒光強(qiáng)度值中減去樣本孔的熒光強(qiáng)度值。ΔF值表示相對(duì)的Caspase-3活性。

一般注意事項(xiàng)  

- 對(duì)于未在96孔板中培養(yǎng)的細(xì)胞，需要單獨(dú)制備細(xì)胞裂解液，并用于Caspase檢測(cè)。  

- 在細(xì)胞經(jīng)過(guò)測(cè)試化合物處理一段時(shí)間后，去除培養(yǎng)基。對(duì)于貼壁細(xì)胞，直接吸出培養(yǎng)基；對(duì)于懸浮細(xì)胞，以500 x g離心5分鐘并吸出培養(yǎng)基。  

- 向每10?個(gè)細(xì)胞加入300 ?L裂解液（50 mM Hepes，pH 7.2；100 mM NaCl；0.5%（體積比）Triton X-100）裂解細(xì)胞。  

- 在4°C下振蕩細(xì)胞懸浮液30分鐘。  

- 在4°C下以2,500 x g離心細(xì)胞懸浮液10分鐘。  

- 將上清液轉(zhuǎn)移至干凈的試管中。如果當(dāng)天不進(jìn)行檢測(cè)，裂解液可在-80°C下保存一個(gè)月。  

- 檢測(cè)時(shí)，將50 ?L樣本裂解液加入黑色96孔板的不同孔中。立即向每個(gè)檢測(cè)孔中加入100 ?L工作試劑。在37°C下避光孵育微孔板60分鐘。在激發(fā)/發(fā)射波長(zhǎng)=400/490 nm處讀取熒光強(qiáng)度。

標(biāo)準(zhǔn)曲線

左圖：在RBL-2H3和PANC-1細(xì)胞系中，staurosporine誘導(dǎo)Caspase-3活性的時(shí)間過(guò)程。  

右圖：在RBL-2H3（EC?? = 14.2 nM）和PANC-1（EC?? = 13.9 nM）細(xì)胞系中，staurosporine誘導(dǎo)Caspase-3活性。

文學(xué)：

1. Hug H et al (1999). Rhodamine 110-linked amino acids and peptides as substrates to measure caspase activity upon apoptosis induction in intact cells. Biochemistry 38:13906-11.

2. Jones J, et al (2000). Development and application of a GFP-FRET intracellular caspase assay for drug screening. J Biomol Screen. 5:307-18.

3. Wang ZQ, et al (2005). N-DEVD-N'-morpholinecarbonyl-rhodamine 110:novel caspase-3 fluorogenic substrates for cell-based apoptosis assay.Bioorg Med Chem Lett. 15:2335-8.

BioAssay Systems是一家位于美國(guó)北加州灣區(qū)的高新技術(shù)生物技術(shù)公司，專注于研發(fā)、生產(chǎn)和銷(xiāo)售高品質(zhì)的生化檢測(cè)試劑盒，產(chǎn)品種類齊全，主要用于科學(xué)研究和生物醫(yī)藥開(kāi)發(fā)，以滿足生命科學(xué)行業(yè)日益增長(zhǎng)的需求。BioAssay Systems在現(xiàn)代藥物發(fā)現(xiàn)領(lǐng)域擁有超過(guò)50年的豐富經(jīng)驗(yàn)，已經(jīng)開(kāi)發(fā)了超過(guò)250種用于藥物發(fā)現(xiàn)和生命科學(xué)研究的檢測(cè)試劑盒。產(chǎn)品主要包括：1.血液尿液化學(xué)；2.酶活性測(cè)定；3.能量代謝；4.氧化應(yīng)激；5.高通量HTS試劑；6.陰陽(yáng)離子檢測(cè)。

作為BioAssay Systems在中國(guó)區(qū)域的代理，艾美捷科技有限公司將為中國(guó)客戶提供全面的BioAssay Systems產(chǎn)品。